趙海霞，華惠敏，吳桂君

（銀川能源學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，寧夏 永寧 750105）

近年來，蘋果酒因含有蘋果與生物發(fā)酵所產(chǎn)生的雙重營養(yǎng)成分，具有抗衰老、軟化血管降血脂及美容養(yǎng)顏等保健作用[1]而受到越來越多的消費(fèi)者青睞。目前，我國生產(chǎn)蘋果酒使用的酵母多為葡萄酒等其他果酒專用釀酒酵母，而缺少蘋果酒專用發(fā)酵菌種，而優(yōu)良蘋果酒的發(fā)酵不是僅由單一酵母完成的，單一酵母往往會造成產(chǎn)品風(fēng)味上的缺陷，口味較平淡[2]。所以人們試圖利用具有增加蘋果酒香氣風(fēng)味的非酵母屬酵母和具有高發(fā)酵效率的酵母屬酵母進(jìn)行混合發(fā)酵釀造蘋果酒，既增加蘋果酒中的酯香物質(zhì)含量，同時(shí)又保證了用于蘋果酒發(fā)酵的酵母具有較高的發(fā)酵效率。果酒發(fā)酵中賦予酒香的酵母被稱為產(chǎn)香酵母，如孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、克勒克酵母屬（Klaeckera）、假絲酵母屬（Candida）和畢赤酵母屬（Pichia）等[3]。它們在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一些高級醇、低級脂肪酸和酯類等芳香物質(zhì)，使得果酒氣味芬芳，果香濃郁[4]。

因此，本文針對蘋果酒釀造中所需菌種缺乏的現(xiàn)狀，通過測定從自然界分離的4株產(chǎn)香酵母對160 mg/L的SO2和10%vol酒精度的耐受性后，與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵試驗(yàn)，選出J-4號菌更適合作為蘋果酒釀造的產(chǎn)香酵母。其發(fā)酵所得蘋果酒品質(zhì)優(yōu)，且酒的香味濃郁，風(fēng)味飽滿，酒體醇厚，具有蘋果酒的典型風(fēng)味，適用于果酒生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤：采自寧夏銀川市永寧縣小任果業(yè)蘋果園中；紅富士蘋果：購自永寧縣小任果業(yè)。

“安琪”果酒用高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；N號釀酒酵母：北方民族大學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，瓊脂2%。

YEPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：寧夏紅富士清洗、破碎、榨汁，用白砂糖調(diào)整果汁糖度，使含糖量為216g/L，用酒石酸、碳酸鈣調(diào)整果汁的酸度，使酸含量為（以酒石酸計(jì)）6 g/L，添加H2SO3（按6%添加量），使SO2含量為80 mg/L，采用巴氏消毒法滅菌，65℃30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇中凈化設(shè)備有限公司；（LED）XSP-10C顯微鏡：上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司；756MC型紫外可見光分光光度計(jì)：上海舒耀儀器設(shè)備有限公司；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；LDZX-50KBS立式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HR-200電子分析天平：日本A&D 公司；DELTA320 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；微量可調(diào)式移液槍：Gilson；BCD-219D冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離

無菌稱取10 g土壤放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩均勻，制成菌懸液，以10-3、10-4、10-5及10-6為濃度梯度，每皿接種量200 μL的接種量，每濃度3個(gè)平行進(jìn)行YEPD固體涂布分離酵母菌。

1.3.2 產(chǎn)香酵母的篩選

產(chǎn)香酵母的初篩：將分離出來的酵母菌株，接種YEPD液體培養(yǎng)基活化后接種到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察，篩選出能產(chǎn)氣味的菌株。

傳代培養(yǎng)：篩選的野生酵母一般性能不穩(wěn)定，為了保證后續(xù)試驗(yàn)的順利進(jìn)行，將已經(jīng)純化的產(chǎn)香酵母進(jìn)行傳代培養(yǎng)5～6次，將性能穩(wěn)定優(yōu)良的菌種進(jìn)行YEPD培養(yǎng)基斜面保存。

1.3.3 產(chǎn)香酵母的性能測定[5]

對初次篩選的產(chǎn)香酵母進(jìn)行耐SO2及耐酒精性進(jìn)行測定。

（一）耐酒精能力的測定

配置YEPD液體培養(yǎng)基使酒精度分別為8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol；將各梯度培養(yǎng)液分別分裝，每支試管裝液量10 mL，每個(gè)菌種做3個(gè)平行，每管中接入菌懸液0.5 mL，菌懸液濃度為107個(gè)/mL。以安琪牌果酒釀酒酵母為對照，32 ℃，180 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)24 h后600 nm處測定吸光度值，用比濁法測定菌體生長量以確定酵母菌的耐酒精能力并進(jìn)行美蘭染色鏡檢。

（二）耐SO2性能的測定

分別配置SO2含量為100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液體培養(yǎng)。分別分裝，每支試管裝液量10 mL，每個(gè)菌種做3個(gè)平行，以安琪牌果酒釀酒酵母為對照，32 ℃，180 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)24 h后600 nm處測吸光度值，用比濁法測定菌體生長量以確定酵母菌耐SO2的性能。

1.3.4 產(chǎn)香酵母的復(fù)篩

將初篩出的各產(chǎn)香酵母與N號菌按1∶1混合，同時(shí)，以“安琪”果酒專用高活性干酵母為對照K，分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為250 mg/L，室溫發(fā)酵，測定其還原糖、滴定酸的變化，當(dāng)其還原糖含量＜5 g/L時(shí)，用蒸餾比重法測其酒精度，并對其進(jìn)行感官評定，主要是評定各菌種在有酒精產(chǎn)生的環(huán)境中，芳香物質(zhì)的產(chǎn)生情況，篩選出適合蘋果酒釀造的產(chǎn)香能力強(qiáng)的菌種。

1.3.5 酵母的分子鑒定

取0.2 g左右研磨好的樣品，采用KI法[6]提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

ITS擴(kuò)增及檢測：參照ITS通用引物序列[7]及GenBank中登錄的Cortinarius屬rDNA ITS序列，設(shè)計(jì)引物對序列為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由TaKaRa公司進(jìn)行合成。

50 μL擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTP 2.5 μL，引物各1 μL，模板0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 39 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后，加6×上樣緩沖液混勻，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.6 測定方法

還原糖測定方法[8]：斐林試劑法。

酸的測定方法[8]：酸堿中和滴定法。

酒精度測定方法[8]：蒸餾比重法。

果酒感官評定[9]：依據(jù)GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中果酒感官評定表對其進(jìn)行打分。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香酵母初篩結(jié)果

根據(jù)菌落形態(tài)、顯微觀察以及平皿的香味評定初次篩選出5株形態(tài)、香味各異的酵母菌。

表1 5株酵母菌菌落特征與菌體形態(tài)Table 1 Colony morphology and mycelial morphology of 5 strains

從表1看出J-3在固體平板上培養(yǎng)，散發(fā)出異臭味被淘汰，其他菌用斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 產(chǎn)香酵母的性能測定結(jié)果

（1）產(chǎn)香酵母對酒精耐受力的測定結(jié)果：

在一定濃度范圍內(nèi)，菌懸液中細(xì)胞濃度與液體光密度成正比，與透光度成反比，通過比濁法測培養(yǎng)24 h后菌的濃度來反應(yīng)各菌在不同濃度酒精培養(yǎng)基中的生長情況。由圖1看出，產(chǎn)香酵母在含10%vol酒精的液體培養(yǎng)基中，4株菌的OD值均＞0.10，4株產(chǎn)香酵母在此酒精濃度中菌體生長良好，為了更好的確定4株菌的形態(tài)和出芽情況，進(jìn)行了美藍(lán)染色的酵母菌死活細(xì)胞鑒定，鏡檢結(jié)果見圖2。由圖2可知，4株菌出芽情況好且活細(xì)胞多。產(chǎn)香酵母的耐酒精能力到10%vol，而果酒的酒精度一般＜10%vol，故而4株菌均適用于蘋果酒的釀造。在其他濃度14%vol～16%vol中OD值的波動較大，甚至出現(xiàn)OD值＜0.10的情況，菌體的長勢參差不齊。在蘋果酒發(fā)酵過程中，酵母代謝的主要產(chǎn)物是乙醇，酒精度過高會對產(chǎn)香酵母的新陳代謝產(chǎn)生抑制作用[10]，因此具有酒精抗性的產(chǎn)香酵母有利于蘋果酒混合發(fā)酵的順利進(jìn)行。

圖1 產(chǎn)香酵母對酒精耐受力的測定結(jié)果Fig.1 Ethanol tolerance of aroma-producing yeast

圖2 4株菌在10 %vol酒精液體培養(yǎng)基中美藍(lán)染色結(jié)果Fig.2 Dyeing results of 4 strains cultured in 10 %vol alcohol liquid medium with methylene blue

（2）產(chǎn)香酵母對SO2的耐受性的測定結(jié)果：

從圖3中看出，4株產(chǎn)香酵母分別在SO2含量為100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液體培養(yǎng)基中測得OD值均0.25，且都耐受160 mg/L SO2，其中J-1和J-2在4個(gè)含SO2濃度梯度的培養(yǎng)基中測得的OD值在0.3左右，菌體生長慢，J-4和J-5 在4個(gè)含SO2濃度梯度的培養(yǎng)基中測得的OD值在0.65左右，菌體生長快。SO2具有光譜抗菌活性，在果酒釀造中主要起殺菌的作用。在一定濃度下，SO2可以抑制或殺死酵母細(xì)胞。在蘋果酒釀造過程中，對SO2有較高耐受力的產(chǎn)香酵母更適合作為釀酒菌種，因此J-4和J-5更適合果酒釀造。

圖3 產(chǎn)香酵母的耐SO2能力Fig.3 SO2resistant capacity of aroma-producing yeast

2.3 產(chǎn)香酵母復(fù)篩結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵過程的還原糖變化

用菲林試劑法測定發(fā)酵過程中還原糖的變化，從圖4可以看出，各個(gè)菌發(fā)酵過程中還原糖逐漸減少，發(fā)酵過程順利穩(wěn)定進(jìn)行。J-5菌因在發(fā)酵結(jié)束后糖含量為9.1g/L，與其他菌相比較，還原糖含量較高、發(fā)酵能力較弱而被淘汰。J-1、J-2、J-4菌發(fā)酵結(jié)束后還原糖含量＜4 g/L，有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，但J-1和J-2耐受SO2的能力較差，所以J-4在整個(gè)發(fā)酵過程中較其他篩選菌發(fā)酵能力較強(qiáng)，更適合作為蘋果酒的釀造菌。

圖4 發(fā)酵過程的還原糖含量變化Fig.4 Reducing sugar changes during fermentation process

2.3.2 果酒的感官評定

從表2中看出，J-1、J-2和N號釀酒酵母混合發(fā)酵，酒精度低，感官評定結(jié)果差，香味不佳；J-4、J-5和N號葡萄酒釀酒酵母混合發(fā)酵，酒精度較前兩者高，感官評定結(jié)果好，蘋果香味濃，尤其是J-4號菌，綜合評定得分最高，確定出J-4號菌為蘋果酒釀造的最佳產(chǎn)香酵母。

表2 蘋果酒評定結(jié)果Table 2 Evaluation result of cider

2.4 J-4菌分子鑒定結(jié)果

分子測序結(jié)果：

5′-GGGATGGCATCTACTGATTTGAGGTCAACTT GATGATATTAAAAGCAACCCTTTGCCTAAGGTACAT TACCATTTCCCTTGTAAAGTAAAACGAATAAATCCA TAAATACATCACAGCGAGAACAGCGTCTCCAAAGA AGCTAAGTGTTGAATTAAAAAAGACTGAAACAGTC TCCAATTTCAAGCTAACCCTGAGTATCGCCCACAAC CAAAAGTTAATAAATTATCTTTTGAGAAGGAAATG A CGCTCAAACAGGCATGCCCCTGAGAATGCTCAAG GGCGCAATGTGCGTTCAAAAATTCAATGATTCACGA GTATCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTA CGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTG TTGAAAGTTTTAAATTATTT TAAAATTTCCGTTAGG AATTTTGGTTTAGTTTAAAAAATATAATAAAATATA ACTGTTTGTGTTTGTTTTTTGCCTTGAACCTTTCGAT TCAAAGCAGAAAGAATTAAATTAAAGTAAAAAACT CCAATGGGGG-3′。

根據(jù)測序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫檢索可知：J-4號菌，其序列與Genebank上Hanseniaspora thailandicaAB501147.1相似度達(dá)到99%，認(rèn)定該菌為孢漢遜酵母屬。本屬的真菌有別于其他酵母菌的主要特征，發(fā)酵力強(qiáng)，產(chǎn)酯香良好，可增加釀造產(chǎn)品的風(fēng)味[11]。

3 結(jié)論

通過初篩、復(fù)篩，獲得1株適用于蘋果酒發(fā)酵用的產(chǎn)香酵母J-4。經(jīng)初步的發(fā)酵試驗(yàn)綜合評價(jià)，J-4號菌是適合蘋果酒釀造的產(chǎn)香酵母。分子測序結(jié)果顯示，該菌屬于孢漢遜酵母屬。對菌株J-4進(jìn)行蘋果酒發(fā)酵的工藝條件，如釀酒酵母的添加量及兩者最佳比例、糖濃度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵速度、降糖能力、產(chǎn)酒精能力及溫度等一系列的研究將在后續(xù)試驗(yàn)中繼續(xù)進(jìn)行，從而為完善我國蘋果酒釀造工藝及釀造菌種提供依據(jù)。

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