李 斌，鐘春燕，王錫彬，王志國(guó)，向 東*

（1.海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南椰國(guó)食品有限公司，海南 ?？?570311）

海南自1997年開始，利用豐富的椰子水資源作為培養(yǎng)基，以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為菌種生產(chǎn)細(xì)菌纖維素凝膠食品，商品名稱為椰纖果或椰子納塔，通常由菠蘿汁生產(chǎn)的納塔稱之為菠蘿納塔，由椰子水生產(chǎn)的納塔稱之為椰子納塔。海南目前主要以椰子水進(jìn)行納塔生產(chǎn)，年生產(chǎn)能力將近30萬t，產(chǎn)值超過10億元，是近年來海南新興的食品工業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。

關(guān)于細(xì)菌纖維素研究目前集中于基礎(chǔ)發(fā)酵方面，如通過誘變篩選高產(chǎn)菌株[1-2]、優(yōu)化培養(yǎng)基配方[3-5]、發(fā)酵工藝的優(yōu)化等[6-11]。采用非椰子水發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素食品近年來也有報(bào)道[12-13]，但限于產(chǎn)業(yè)鏈區(qū)域分布的關(guān)系，均未形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。海南地區(qū)利用椰子水生產(chǎn)細(xì)菌纖維素歷史接近20年，近年來隨著椰子原料的缺乏和價(jià)格上漲，逐步有納塔生產(chǎn)企業(yè)探索采用菠蘿汁、芒果汁生產(chǎn)細(xì)菌纖維素凝膠，但未進(jìn)行深入的研究。本研究將椰子水和菠蘿汁作為主要原料，從前期發(fā)酵產(chǎn)酸、發(fā)酵周期以及細(xì)菌纖維素密度等方面進(jìn)行了全面對(duì)比，對(duì)于利用非椰子水資源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素凝膠具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)菌：木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001，海南大學(xué)食品綜合實(shí)驗(yàn)室保藏；椰子水、菠蘿汁前期發(fā)酵產(chǎn)酸菌：木醋桿菌（Acetobacter xylinium）YG002，海南椰國(guó)食品有限公司保藏。

硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為分析純：上海國(guó)藥集團(tuán)；生化試劑蛋白胨：上海生工公司。

椰子水：取自海口本地市售的新鮮椰子；菠蘿汁：由海口本地市售的新鮮菠蘿打漿過濾獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌株HN001、YG002種子液培養(yǎng)基：新鮮椰子水70 mL，硫酸銨0.1 g，硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.1 g，蔗糖4.0 g，蛋白胨0.1 g，蒸餾水30 mL，pH值自然，100 ℃滅菌5 min。細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)培養(yǎng)基：

（1）椰子水培養(yǎng)基：發(fā)酵椰子水50 mL，硫酸銨0.1 g，硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.1 g，蔗糖3.0 g，蒸餾水50 mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.1，100 ℃滅菌5 min。

（2）菠蘿汁培養(yǎng)基：發(fā)酵菠蘿汁50 mL，硫酸銨0.1 g，硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.1 g，蔗糖3.0 g，蒸餾水50 mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.1，100 ℃滅菌5 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SHP-1500生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 前期發(fā)酵產(chǎn)酸

無論是椰子水還是菠蘿汁，新鮮的果汁用于生產(chǎn)細(xì)菌纖維素效果較差，這是因?yàn)槠渲腥狈δ敬讞U菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素所需的有機(jī)酸、微生物菌體等重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，不同有機(jī)酸對(duì)木醋桿菌產(chǎn)纖維素的影響也不盡相同[14]。鑒于有機(jī)酸對(duì)木醋桿菌產(chǎn)纖維素的重要影響，必須對(duì)椰子水、菠蘿汁進(jìn)行前期發(fā)酵才能作為細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基質(zhì)使用，前期發(fā)酵液的酸度對(duì)于后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素凝膠具有重要的參考意義，將酸度作為前期發(fā)酵的主要指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，酸度越高表明前期發(fā)酵效果越佳。目前椰子納塔工業(yè)化生產(chǎn)前主要采用自然發(fā)酵的方式，這種發(fā)酵方式操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)酸量高，但由于自然感染的未知微生物，不能保證食品安全性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性；菠蘿汁與椰子水在成分上有較大差異（如還原糖、微量元素含量等），采用自然發(fā)酵的方式往往不能獲得滿意的結(jié)果，本研究菠蘿汁前發(fā)酵采用接種產(chǎn)酸菌種進(jìn)行發(fā)酵，旨在和現(xiàn)有的納塔生產(chǎn)前期發(fā)酵工藝進(jìn)行比較。

椰子水前期產(chǎn)酸：模擬目前椰子納塔的生產(chǎn)工藝，剖開新鮮椰子，取椰子水，自然放置暴露于空氣中進(jìn)行自然發(fā)酵，采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的方法每天測(cè)定發(fā)酵椰子水的總酸含量[15]。

菠蘿汁前期產(chǎn)酸：將新鮮的菠蘿汁滅菌后接種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）YG002，進(jìn)行前期產(chǎn)酸發(fā)酵，采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的方法每天測(cè)定發(fā)酵菠蘿汁的總酸含量。

將椰子水和菠蘿汁前期產(chǎn)酸發(fā)酵的色澤、氣味、總酸量進(jìn)行對(duì)照。

1.3.2 細(xì)菌纖維素凝膠發(fā)酵生產(chǎn)周期的對(duì)比

按1.3.1所述前期發(fā)酵方法，將發(fā)酵的椰子水及發(fā)酵的菠蘿汁按照1.1.2配制培養(yǎng)基，置于250 mL燒杯中，滅菌后接種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001靜置培養(yǎng)。根據(jù)納塔生產(chǎn)企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格，選擇細(xì)菌纖維素凝膠厚度1.2 cm作為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格，比較細(xì)菌纖維素凝膠厚度達(dá)到1.2 cm時(shí)的發(fā)酵生產(chǎn)周期。

1.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌纖維素凝膠纖維密度的影響

木醋桿菌在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵獲得的細(xì)菌纖維素凝膠是纖維素和水結(jié)合的狀態(tài)，其基本結(jié)構(gòu)是：納米級(jí)別直徑的細(xì)菌纖維束形成立體網(wǎng)絡(luò)的骨架，網(wǎng)絡(luò)間的孔隙充滿水分，通常纖維素干質(zhì)量占細(xì)菌纖維素凝膠總質(zhì)量（濕質(zhì)量）的1%以下，而水分質(zhì)量往往超過99%。本研究對(duì)細(xì)菌纖維素凝膠密度作如下定義：?jiǎn)挝惑w積內(nèi)細(xì)菌纖維素凝膠（水合狀態(tài)）的纖維素干質(zhì)量。引入細(xì)菌纖維素凝膠密度及測(cè)定纖維素密度值，可以直接表征細(xì)菌纖維素在水合狀態(tài)下的分布疏密情況。

按1.3.1所述前期發(fā)酵方法，將發(fā)酵的椰子水及發(fā)酵的菠蘿汁按照1.1.2配制培養(yǎng)基，置于250 mL燒杯中，滅菌后接種5%（V/V）木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001靜置培養(yǎng)2～6 d，每天測(cè)定細(xì)菌纖維素凝膠的干質(zhì)量及水合狀態(tài)下的體積，計(jì)算纖維素密度。

細(xì)菌纖維素凝膠干質(zhì)量（m）的測(cè)定：將細(xì)菌纖維素凝膠用蒸餾水洗滌3次后、置于80 ℃干燥至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量。

細(xì)菌纖維素凝膠體積（v）的測(cè)定：取出按上述方法進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素凝膠膜，用半干的濕布拭去其表面多余的水分，放入裝有植物油的1 000 mL量筒中，根據(jù)量筒排出油的體積測(cè)定細(xì)菌纖維素凝膠的體積。細(xì)菌纖維素凝膠密度的計(jì)算公式如下：

式中：ρ為細(xì)菌纖維素密度，kg/m3；m為細(xì)菌纖維素干質(zhì)量，kg；v為細(xì)菌纖維素凝膠體積，m3。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酸分析

表1 椰子水隨發(fā)酵時(shí)間的變化Table 1 Change of coconut water with fermentation time

將新鮮的椰子水暴露于空氣中，由于椰子水中感染了空氣中的微生物，這些微生物代謝后產(chǎn)生了大量的酸，新鮮的椰子水隨發(fā)酵時(shí)間的增加產(chǎn)生了較大變化，結(jié)果見表1所示。由表1可知，椰子水顏色逐步由澄清透明變成乳白色，氣味由椰子水原有的清香味變成具有較濃酸味，總酸隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)有顯著增加，但發(fā)酵8 d后總酸增加量開始延緩。

將新鮮的菠蘿汁經(jīng)滅菌后接入前期產(chǎn)酸發(fā)酵菌種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）YG002進(jìn)行發(fā)酵，接種量5%（V/V）。新鮮的菠蘿汁隨發(fā)酵時(shí)間的增加產(chǎn)生了較大變化，結(jié)果見表2所示。由表2可知，菠蘿汁顏色變化不大，氣味由菠蘿汁原有的濃郁香味變成具有較濃酸味，總酸初始量較高，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)有顯著增加，但發(fā)酵3 d后總酸增加量開始延緩，發(fā)酵至5 d后產(chǎn)酸量不再增加，菠蘿汁發(fā)酵后總酸量大于椰子水產(chǎn)酸量。

表2 菠蘿汁隨發(fā)酵時(shí)間的變化Table 2 Change of pineapple juice with fermentation time

2.2 細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)周期的對(duì)比

根據(jù)納塔生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的一般規(guī)格，選擇細(xì)菌纖維素凝膠厚度為1.2 cm時(shí)，采用椰子水培養(yǎng)基采用自然發(fā)酵10 d主要培養(yǎng)基質(zhì)，菠蘿汁培養(yǎng)基采用前期發(fā)酵5 d作為主要培養(yǎng)基質(zhì)，接種5%（V/V）木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001靜置培養(yǎng)，比較2種培養(yǎng)基發(fā)酵細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)周期，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同培養(yǎng)基生產(chǎn)周期對(duì)比Fig.1 Comparison of production period with different culture mediums

由圖1可知，椰子水培養(yǎng)基細(xì)菌纖維素凝膠厚度生長(zhǎng)到≥1.2 cm時(shí)需要7 d，這個(gè)生產(chǎn)周期與目前椰子納塔生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)周期一致。而以菠蘿汁作為培養(yǎng)基生長(zhǎng)到同等厚度則只需要5 d，比通常的椰子納塔生產(chǎn)周期縮短了2 d。這可能是因?yàn)椴ぬ}汁在接種木醋桿菌（Acetobacter xylinum）YG002后發(fā)酵后，其發(fā)酵液中的有機(jī)酸、微生物菌體等能夠促進(jìn)木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001快速代謝產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，而自然發(fā)酵的椰子水其中雖然也含有較多有機(jī)酸，但不能加速HN001代謝產(chǎn)生細(xì)菌纖維素。

2.3 不同培養(yǎng)基細(xì)菌纖維素凝膠纖維素密度的對(duì)比

將椰子水發(fā)酵10 d，菠蘿汁發(fā)酵5 d，獲得最大產(chǎn)酸量后，按照1.3.2所述的方法進(jìn)行細(xì)菌纖維素凝膠的培養(yǎng)，第2天至第6天每天測(cè)定細(xì)菌纖維素凝膠的干質(zhì)量及體積，計(jì)算纖維素密度。不同培養(yǎng)基細(xì)菌纖維素的密度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。

圖2 不同培養(yǎng)基纖維素密度的對(duì)比Fig.2 Comparison of cellulose density with different culture mediums

由圖2可知，椰子水細(xì)菌纖維素的纖維素密度始終大于菠蘿汁細(xì)菌纖維素的密度，表明以發(fā)酵的椰子水為主要原料生產(chǎn)細(xì)菌纖維素時(shí)形成的凝膠更為致密，以手按壓，感覺椰子水培養(yǎng)基生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素凝膠質(zhì)地較硬，而菠蘿汁培養(yǎng)基生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素凝膠質(zhì)地偏軟。這說明以發(fā)酵的椰子水作為培養(yǎng)基，可能更適合木醋桿菌的增殖，能夠形成更高的菌體密度，因此在菌株代謝產(chǎn)纖維素時(shí)單位體積獲得了更高的產(chǎn)量。而菠蘿汁經(jīng)發(fā)酵后，具有更高的酸度，能夠促進(jìn)木醋桿菌迅速代謝細(xì)菌纖維素，但過高的酸度反而可能會(huì)抑制產(chǎn)木醋桿菌的增殖，最終導(dǎo)致菌體密度較低，所形成的細(xì)菌纖維素密度也較椰子水培養(yǎng)基低。

在同等體積下，細(xì)菌纖維素凝膠總質(zhì)量（濕質(zhì)量）的變化取決于纖維素干質(zhì)量的變化，但由于纖維素干質(zhì)量占細(xì)菌纖維素凝膠總質(zhì)量的比例較低（通常1%以下），直接測(cè)定其濕質(zhì)量的變化來表征細(xì)菌纖維素產(chǎn)量存在較大的測(cè)量誤差。農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1522—2007《椰子產(chǎn)品椰纖果》對(duì)細(xì)菌纖維素凝膠中的粗纖維的含量（質(zhì)量百分比）作出了規(guī)定[16]，但這一指標(biāo)無法直觀表征纖維素在細(xì)菌纖維素凝膠水合狀態(tài)下的分布情況。通過對(duì)不同培養(yǎng)基下細(xì)菌纖維素凝膠密度的變化研究，不僅可以獲得微生物產(chǎn)纖維素的分布信息，同時(shí)對(duì)納塔產(chǎn)品出現(xiàn)的質(zhì)構(gòu)變化可以作出合理解釋，如纖維素密度高的納塔產(chǎn)品質(zhì)地較硬，而纖維素密度低的納塔產(chǎn)品質(zhì)地偏軟等。

3 結(jié)論

海南自1997年開始，利用豐富的椰子水資源作為培養(yǎng)基，以木醋桿菌為菌種生產(chǎn)細(xì)菌纖維素凝膠，隨著椰子加工產(chǎn)業(yè)規(guī)模日漸增長(zhǎng)，本省的椰子水資源已逐步不能滿足生產(chǎn)需要。利用豐富的熱帶水果資源，特別是價(jià)值低廉的殘次果資源，作為培養(yǎng)基生產(chǎn)細(xì)菌纖維素是解決椰子水資源不足的研究方向。

本研究利用熱帶水果資源菠蘿汁作為生產(chǎn)培養(yǎng)基，與傳統(tǒng)的椰子水培養(yǎng)基進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明，利用菠蘿汁生產(chǎn)細(xì)菌纖維素具有一定的優(yōu)勢(shì)，如前期發(fā)酵酸度較高，能夠加速木醋桿菌分泌產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，從而獲得較短的生產(chǎn)周期。此外，利用固定的菌種進(jìn)行前期產(chǎn)酸發(fā)酵替代自然發(fā)酵對(duì)于納塔生產(chǎn)的質(zhì)量穩(wěn)定性、食品安全性，以及較高的酸度對(duì)于防止后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程中的雜菌污染，都具有一定的優(yōu)勢(shì)。利用菠蘿汁作為培養(yǎng)基，其在增殖木醋桿菌菌體方面弱于椰子水，從而導(dǎo)致產(chǎn)品纖維素密度較低，這對(duì)于最終產(chǎn)品的品質(zhì)可能會(huì)有一定影響，如何克服這一劣勢(shì)，是今后利用非椰子水資源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素需要解決的問題之一。

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