李秀萍，鄭 平，吳幼茹，鄒 毅，李 楠*

（1.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004）

廣西是我國(guó)最大的甘蔗種植地，擁有非常豐富甘蔗資源。甘蔗制糖為傳統(tǒng)甘蔗產(chǎn)業(yè)，目前為了提高甘蔗產(chǎn)業(yè)鏈，增加甘蔗工業(yè)產(chǎn)值，可以利用甘蔗豐富的糖分和富含人體非常有益的維生素、礦物質(zhì)元素及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵生產(chǎn)具有獨(dú)特、濃郁甘蔗清香的果酒[1]。甘蔗果酒的釀造關(guān)鍵在于發(fā)酵菌株的篩選，而甘蔗生產(chǎn)酒精所選用的酵母發(fā)酵性能直接影響到果酒的風(fēng)味。本實(shí)驗(yàn)利用甘蔗蔗汁分別以現(xiàn)有的4株釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵試驗(yàn)，篩選出1株適宜甘蔗酒釀造的釀酒酵母，同時(shí)對(duì)優(yōu)選酵母耐性及發(fā)酵溫度、pH進(jìn)行相關(guān)分析，以便有效地將該酵母應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，推動(dòng)甘蔗果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗汁：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地提供甘蔗自行壓榨蔗汁及廣西南寧糖業(yè)股份明陽(yáng)糖廠提供。

菌株：4株酵母菌（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院朗姆酒研發(fā)實(shí)驗(yàn)室自選），分別為：1308，1042，31105和32481。

硫酸銨（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氧化鈣（分析純）：南京化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；95%乙醇（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

斜面培養(yǎng)基、平板培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基[2]；種子培養(yǎng)基采用甘蔗汁液體培養(yǎng)基，將甘蔗汁的初糖濃度調(diào)整到13°Bx，添加0.2%（NH4）2SO4及0.6%KH2PO4，用濃硫酸調(diào)節(jié)pH至4.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗汁液體培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)節(jié)甘蔗汁的糖度，添加0.2%（NH4）2SO4及0.6%KH2PO4，用濃硫酸調(diào)節(jié)至適宜pH值。

所有培養(yǎng)基在121 ℃、20 min條件下滅菌，冷卻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

RE301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：重慶雅瑪拓科技有限公司；ZH WY-211B新型大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；Sup-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PAL迷你數(shù)顯折射計(jì)：廣州市愛(ài)宕科學(xué)儀器有限公司；酒精計(jì)：余姚儀表二廠有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 甘蔗果酒的制備

選取新鮮甘蔗，壓榨，紗布過(guò)濾，得蔗汁置于80 ℃水浴保溫30 min，加入新配制石灰乳調(diào)節(jié)pH值至7.0，靜置取其上清液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要濃縮甘蔗汁至適宜糖度，添加0.2%（NH4）2SO4及0.6%KH2PO4，用濃硫酸調(diào)節(jié)至適宜pH值，以300 mL/500 mL的裝液量裝入三角瓶中，按體積分?jǐn)?shù)10%的菌種量接種到甘蔗汁發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酸制備甘蔗果酒。

1.3.2 選育酵母產(chǎn)酒精性能的測(cè)試

甘蔗汁糖度自然，調(diào)節(jié)初始pH值為4.0，按體積分?jǐn)?shù)10%的菌種量將酵母種子培養(yǎng)液接種到甘蔗汁液體發(fā)酵液中，28 ℃靜置發(fā)酵7 d，分別測(cè)定發(fā)酵液中的酒精和殘?zhí)呛浚鶕?jù)酒精產(chǎn)量、出酒率、發(fā)酵效率、糖利用率確定1株適宜利用甘蔗汁發(fā)酵的釀酒酵母。

1.3.3 繪制優(yōu)選酵母生長(zhǎng)曲線及測(cè)定不同生長(zhǎng)時(shí)間甘蔗汁

糖度的變化

按體積分?jǐn)?shù)1%接種量將優(yōu)選酵母接種至以50 mL/150 mL裝液量的種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h，每隔2 h取培養(yǎng)液稀釋至合適倍數(shù)，并以未接種的甘蔗汁液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定其OD560nm值[3]，同時(shí)對(duì)甘蔗汁培養(yǎng)液不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行殘?zhí)菧y(cè)定。以O(shè)D560nm值及殘?zhí)呛繛榭v坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制優(yōu)選酵母生長(zhǎng)曲線及不同生長(zhǎng)時(shí)間甘蔗汁糖度的變化情況。

1.3.4 優(yōu)選酵母抗性試驗(yàn)測(cè)試

（1）耐酒精性能試驗(yàn)

按表1調(diào)節(jié)培養(yǎng)液乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為12%、14%、16%、18%、20%，以10%的接種量將種子液接入不同乙醇含量的培養(yǎng)液中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，取培養(yǎng)液稀釋液涂布平板檢測(cè)培養(yǎng)液中的酵母數(shù)，比較酵母數(shù)確定優(yōu)選酵母的耐酒精性能[4]。

表1 耐酒精度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液配比Table 1 Broth ratio of alcohol tolerance test

（2）耐糖性能試驗(yàn)

將甘蔗汁濃縮，調(diào)整初始糖度分別為16°Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx、28 °Bx、30 °Bx、32 °Bx、34°Bx、36°Bx、38°Bx，調(diào)節(jié)pH值至4.5，以300mL/500 mL的裝液量裝入三角瓶中，按體積分?jǐn)?shù)10%菌種量接入，在28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)19 h酵母種子培養(yǎng)液，置于28 ℃靜置發(fā)酵7 d后，測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇和殘?zhí)呛浚ㄟ^(guò)最終的酒精度和殘?zhí)谴_定優(yōu)選酵母的耐糖性能。

1.3.5 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵溫度和初始pH的確定

（1）最適發(fā)酵溫度

調(diào)整甘蔗汁糖度為26 °Bx，調(diào)節(jié)初始pH值為4.5，按10%菌種量接入，在28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)19 h的酵母種子培養(yǎng)液，分別置于22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃靜置發(fā)酵發(fā)酵7 d后，測(cè)定發(fā)酵液中的酒精和殘?zhí)呛俊?/p>

（2）最適發(fā)酵初始pH

調(diào)整甘蔗汁糖度為26°Bx，用濃硫酸調(diào)節(jié)初始pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，按體積分?jǐn)?shù)10%菌種量接入，在28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)19 h酵母種子培養(yǎng)液，置于28 ℃靜置發(fā)酵7 d后，測(cè)定發(fā)酵液中的酒精和殘?zhí)呛俊?/p>

1.3.6 分析方法

總糖含量的測(cè)定采用手持式折光儀法；酒精度的測(cè)定采用酒精計(jì)法[5]；酵母數(shù)目的測(cè)定采用計(jì)數(shù)法[6]。糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率計(jì)算公式如下[7]：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀酒酵母產(chǎn)酒精能力的比較

釀酒酵母品種繁多，性能各異，不同酵母菌株的代謝過(guò)程有差異，對(duì)可發(fā)酵性糖的利用程度不同，而酵母本身的性能是影響果酒品質(zhì)的重要因素，其選擇會(huì)導(dǎo)致最終發(fā)酵酒精生成率有較大差別，也直接影響了果酒的感官和理化品質(zhì)[8]。甘蔗果酒生產(chǎn)中，酒精是酵母利用發(fā)酵性糖而產(chǎn)生的，因此把利用發(fā)酵性糖發(fā)酵生成酒精的能力作為衡量?jī)?yōu)良酵母的一項(xiàng)重要指標(biāo)[9]，各酵母菌株的發(fā)酵產(chǎn)酒及發(fā)酵液中殘?zhí)呛壳闆r分別見(jiàn)圖1和圖2。

由圖1可知，發(fā)酵結(jié)束后，菌株32481乙醇最高，發(fā)酵液中殘?zhí)呛孔畹?，最終乙醇含量達(dá)到12.6%（V/V）；由圖2可知，菌株32481發(fā)酵出酒率為42.48%，發(fā)酵效率為83.13%，糖的利用率42.48%，在4株釀酒酵母中均為最高。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明菌株32481發(fā)酵能力較強(qiáng)、產(chǎn)酒精的能力最好，因此，確定了菌株32481為最佳甘蔗果酒發(fā)酵酵母。

圖1 不同釀酒酵母產(chǎn)酒精能力及殘?zhí)呛縁ig.1 Different Saccharomyces cerevisiae alcohol production capacity and residual sugar content

圖2 不同釀酒酵母發(fā)酵出酒率、發(fā)酵率、糖利用率情況Fig.2 Different yeast fermentation alcohol yield,fermentation rate and sugar utilization situation

2.2 優(yōu)選酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及不同生長(zhǎng)時(shí)間甘蔗汁糖度的變化

圖3 酵母菌生長(zhǎng)曲線及不同生長(zhǎng)時(shí)間甘蔗汁糖度的變化情況Fig.3 Yeast growth curve and change of sugarcane juice sugar content in different growth period

隨著酵母菌的生長(zhǎng)，甘蔗汁培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)被消耗，發(fā)酵液中的糖逐漸被轉(zhuǎn)化為酒精，導(dǎo)致甘蔗汁的糖度逐漸降低。由圖3可以看出，優(yōu)選酵母的生長(zhǎng)曲線符合“S”型生長(zhǎng)模型，在接種初期0～8 h，為酵母生長(zhǎng)延遲期，在這一階段，酵母數(shù)目及甘蔗汁培養(yǎng)基中的殘?zhí)呛孔兓淮螅L(zhǎng)速率幾乎為零；8～18 h為酵母生長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這一階段酵母代謝旺盛、大量繁殖，酵母數(shù)目迅速增加，培養(yǎng)基中的殘?zhí)呛恳惭杆俳档停L(zhǎng)速率達(dá)到最大；培養(yǎng)至18 h后酵母細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，由于各種理化條件逐漸不適宜酵母生長(zhǎng)，此時(shí)活細(xì)胞數(shù)及培養(yǎng)基中殘?zhí)呛勘３窒鄬?duì)穩(wěn)定。因此，在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)選擇19 h為酵母種子的接種齡接種至甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵。

2.3 耐性試驗(yàn)

2.3.1 耐酒精性能試驗(yàn)

酒精生產(chǎn)過(guò)程中，由于酒精度的提高可以降低蒸餾時(shí)的能耗，發(fā)酵時(shí)應(yīng)盡可能地提高成熟醪的酒精度，而酒精含量對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)影響很大[10]，過(guò)高的乙醇含量對(duì)酵母本身具有毒性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，能抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)及繁殖能力，從而殺死酵母，因此要求生產(chǎn)中的酵母要具備一定的耐受酒精的能力[11-12]。

表2 優(yōu)選酵母對(duì)酒精的耐受能力Table 2 Alcohol tolerance ability of preferred yeast

從酵母細(xì)胞數(shù)可以確定菌株的耐乙醇特性。由表2可以看出，隨著起始乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，各菌株培養(yǎng)液的酵母細(xì)胞數(shù)呈下降的趨勢(shì)。起始的乙醇含量為12%vol～14%vol時(shí)，對(duì)各菌株生長(zhǎng)影響不大，酵母均可正常生長(zhǎng)繁殖；乙醇含量在16%vol～18%vol范圍內(nèi)，酵母菌的生長(zhǎng)量明顯減少，培養(yǎng)液的酵母細(xì)胞數(shù)下降均＞50%；乙醇含量＞18%vol后，酵母基本停止生長(zhǎng)，表明20%vol乙醇含量對(duì)各菌株生長(zhǎng)有較明顯的抑制作用。因此，可以確定優(yōu)選酵母能夠耐受乙醇含量最高為18%vol。

2.3.2 耐糖性能試驗(yàn)

總糖含量是影響酒精發(fā)酵的重要因素，但隨著總糖含量的增加，酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵會(huì)受到一定的抑制，當(dāng)總糖含量＞270 g/L時(shí)，高濃度的糖導(dǎo)致滲透壓增加，抑制細(xì)胞活性，酵母生長(zhǎng)及酒精發(fā)酵緩慢而且糖利用率較低，從而影響最終發(fā)酵效果[13]。

由圖4可知，高濃度的總糖可產(chǎn)生高濃度的酒精，隨著初始糖度的不斷升高，優(yōu)選酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵逐漸受到一定的抑制，發(fā)酵液中的殘?zhí)呛恳搽S之升高，發(fā)酵液中糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率不斷降低。在初始糖濃度為16～26°Bx時(shí)，優(yōu)選酵母可以正常生長(zhǎng)，酒精發(fā)酵沒(méi)有影響，并且隨著初始糖度的增加，酒精發(fā)酵逐漸增強(qiáng)，在初始糖度為26°Bx時(shí)，發(fā)酵液中酒精含量最高；初始糖度＞36°Bx時(shí)優(yōu)選酵母活力迅速降低，酒精發(fā)酵能力受到抑制。因此根據(jù)表7可以確定該優(yōu)選酵母最高耐受糖濃度為36°Bx，說(shuō)明該菌株能耐受較高的滲透壓，有利于今后在高濃度酒精發(fā)酵工藝中應(yīng)用。

圖4 優(yōu)選酵母對(duì)糖度的耐受能力Fig.4 Sugar tolerance ability of preferred yeast

2.4 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵溫度和pH值的確定

2.4.1 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵溫度的確定

溫度是影響酵母生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵作用的一個(gè)重要因素[14]。由圖5可知，溫度過(guò)低或過(guò)高均不利于優(yōu)選酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，其中，當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，酒精度達(dá)到最高，糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率最高，故確定優(yōu)選的最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)甘蔗汁酒精度的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on sugar cane juice alcohol content

2.4.2 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵初始pH值的確定

圖6 初始pH值對(duì)甘蔗汁酒精度的影響Fig.6 Effect of initial pH on sugar cane juice alcohol content

pH對(duì)酵母代謝有很大的影響，能夠影響細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力及其生物酶活性[15]。由圖6可知，過(guò)高或過(guò)低的pH會(huì)抑制酵母細(xì)胞酶的活性及阻礙新陳代謝，使得酵母繼續(xù)生長(zhǎng)受阻，從而影響最終發(fā)酵能力，其中，當(dāng)初始pH值為4.5時(shí)，酒精產(chǎn)量達(dá)到最高，糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率最高，故確定優(yōu)選酵母的最適發(fā)酵初始pH值為4.5，此時(shí)甘蔗果酒的酒精度為13.4%vol，糖利用率為60.38%，出酒率為40.66%，發(fā)酵效率為79.58%。

3 結(jié)論

對(duì)供試4株酵母發(fā)酵特性的對(duì)比研究結(jié)果表明，各酵母在甘蔗汁中產(chǎn)酒精能力大小排序?yàn)?2481＞31105＞1043＞1308，確定了菌株32481為最佳甘蔗果酒發(fā)酵酵母；在酒精發(fā)酵過(guò)程中，溫度、pH值、酒精含量、底物濃度對(duì)酵母發(fā)酵性能影響較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選酵母最高能夠耐受乙醇含量18 %vol、耐受糖濃度為36 °Bx，最佳發(fā)酵初始糖度為26°Bx；最適的發(fā)酵溫度為28 ℃、初始pH值為4.5。在此發(fā)酵條件下，甘蔗果酒的酒精度達(dá)到13.4%vol，糖利用率為60.38%，出酒率為40.66%，發(fā)酵效率為79.58%。優(yōu)選酵母具有產(chǎn)酒率高、耐酒精及耐高糖性能等特點(diǎn)，發(fā)酵所得原酒色澤金黃透亮，果香、酒香濃郁、協(xié)調(diào)。但是，為了使該菌株能夠推廣應(yīng)用，仍需對(duì)菌株的其他特性和發(fā)酵工藝進(jìn)行深入研究。

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