趙小麗，甄玉國 *，王蘭惠，陳 雪

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 吉農(nóng)博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林 長春 130118；2.長春博瑞飼料集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，吉林 長春 130114）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為人類利用最早的微生物，其營養(yǎng)成分十分豐富，含有菌體蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素、脂肪、食物纖維、礦物元素及生理活性物質(zhì)等[1]。由于其具有安全、生長繁殖快、代謝周期短、生產(chǎn)不受季節(jié)和氣候、土壤、自然災(zāi)害的影響，與傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式相比，過程易于控制，容易進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)、菌體蛋白質(zhì)豐富等優(yōu)點(diǎn)，一直是基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的主要對象，并被廣泛應(yīng)用于釀造、食品、醫(yī)藥、飼料工業(yè)等領(lǐng)域[2-4]。實(shí)驗(yàn)室酵母培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量等[5-8]。溫度是影響酵母生長的重要因子，大多數(shù)酵母菌在28～30 ℃時(shí)生物量最大。酵母生長與溶氧速率密切相關(guān)，因此調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與裝液量是調(diào)控酵母生長的有效手段。不同的酵母菌株其生物學(xué)特性也不完全相同[9]，因此本試驗(yàn)針對試驗(yàn)用菌株利用實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的培養(yǎng)基，通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選釀酒酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化組合，為工業(yè)化生產(chǎn)酵母蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

供試菌株由實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)獲得，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

甜菜糖蜜：黑龍江拜泉糖廠；尿素、甘氨酸、硫酸鎂：北京化工廠；紅糖（食品級(jí)）：市售。葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉（N＞9%）、蛋白胨（N＞14.5%）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

酵母液體種子培養(yǎng)基—酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，115 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為試驗(yàn)前期篩選優(yōu)化的培養(yǎng)基：糖蜜總糖含量為10%、紅糖10%、尿素0.5%、酵母粉0.5%、硫酸鎂0.05%、甘氨酸0.05%，115 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。由于尿素在高溫高壓條件下分解，因此將尿素配成一定濃度的水溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后加入滅菌的培養(yǎng)基中。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-2C型數(shù)字式酸度計(jì)：上海SANXIN公司；AL104電子天平：梅特勒-托利多公司；島津UV-1201分光光度計(jì)：日本島津公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(jī)：德國艾本德股份公司；YP1200型電子天平：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HYG-型培養(yǎng)搖床：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；SPX-150 型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-IF型潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化

無菌條件下接1環(huán)保藏菌種至YPD斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h復(fù)蘇菌種。

1.3.2 種子擴(kuò)大培養(yǎng)

取1環(huán)活化后的斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝液量為20 mL/100 mL的種子培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液經(jīng)20倍稀釋后OD560nm達(dá)到0.72。

1.3.3 菌體干質(zhì)量測定

發(fā)酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，蒸餾水洗滌2次后收集菌體，105℃烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20 mL/100 mL，30 ℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，菌體干質(zhì)量為16.63 g/L。分別改變培養(yǎng)時(shí)間、接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速5個(gè)因素，菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以同樣稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)基為空白對照，用紫外可見分光光度計(jì)在波長560 nm處測定光密度值，即OD值。以菌液光密度值為考查指標(biāo)，研究各因素對菌株生物量的影響。

1.3.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對菌體生物量影響較大的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以波長560 nm處的OD值為考查指標(biāo)，研究發(fā)酵條件的最佳組合。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件，Duncan’s 檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

在培養(yǎng)基初始pH5.0，培養(yǎng)基裝液量20 mL/100 mL，溫度30 ℃，4%接種量，轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)菌體，分別在24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取樣，發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定OD560nm。培養(yǎng)時(shí)間對菌體OD560nm的影響見圖1。

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體密度呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，經(jīng)單因素方差分析，培養(yǎng)48 h與60 h的菌密度差異不顯著（P＞0.05）；因此從時(shí)間效率考慮培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對菌體OD560nm的影響Fig.1 Effect of culture time on cell OD560nm

2.1.2 培養(yǎng)溫度的選擇

在培養(yǎng)基初始pH5.0，培養(yǎng)基裝液量20 mL/100 mL，時(shí)間48 h，6%接種量，轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)菌體，將培養(yǎng)溫度設(shè)置為26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定OD560nm。培養(yǎng)溫度對菌體OD560nm的影響見圖2。

圖2 培養(yǎng)溫度對菌體OD560nm的影響Fig.2 Effect of culture temperature on OD560nm

在發(fā)酵過程中，溫度的變化將導(dǎo)致微生物生長和繁殖速度的改變以及微生物酶活性的變化，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。外部環(huán)境溫度的升高和微生物自身代謝放出的熱量，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵溫度升高，影響菌體的繁殖代謝[10]。由圖2可知，低溫培養(yǎng)較高溫培養(yǎng)時(shí)菌密度偏高，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)溫度偏低，使得菌體細(xì)胞內(nèi)酶的催化活性較低，延緩了菌體組成物質(zhì)的合成速度，抑制細(xì)胞生長的代謝產(chǎn)物的積累速度放緩，從而有利于細(xì)胞的增殖；培養(yǎng)溫度偏高，培養(yǎng)初期細(xì)胞生長繁殖很快，但由于供氧速度的限制和不利于生長的代謝產(chǎn)物的積累，影響了最終的細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)單因素方差分析28 ℃條件下菌密度顯著高于30 ℃和26 ℃條件下的菌密度（P＜0.05），因此選擇28 ℃作為適宜的培養(yǎng)溫度。

2.1.3 接種量的選擇

在培養(yǎng)基初始pH 5.0，培養(yǎng)基裝液量20 mL/100 mL，溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h，轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)菌體，將接種量分別設(shè)定為2%、4%、6%、8%，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定OD560nm。不同接種量對菌體OD560nm的影響見圖3。

圖3 接種量對菌體OD560nm的影響Fig.3 Effect on inoculums on cell OD560nm

由圖3可知，菌密度在接種量為2%～6%范圍內(nèi)隨著接種量的增加而增大，因?yàn)榕囵B(yǎng)基所提供的營養(yǎng)水平和溶氧速率只能滿足一定數(shù)量酵母細(xì)胞生長繁殖所需。當(dāng)接種量超過6%后，一方面造成一部分細(xì)胞的營養(yǎng)供給不足，從而限制這一部分菌體的生長繁殖，另一方面由于接種量過大，即使培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的供給能夠滿足其生長，但由于溶氧速率的延后性，不能滿足生長旺盛細(xì)胞對氧的需求，從而使細(xì)胞從有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醮x，伴隨厭氧代謝物（如乙醇）的積累抑制了細(xì)胞的生產(chǎn)，反而降低了最終的細(xì)胞濃度。過高的接種量對增加酵母數(shù)沒有積極的影響，因此選擇6%作為適宜的接種量。

2.1.4 初始pH值的選擇

在培養(yǎng)基裝液量20 mL/100 mL，溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h，6%接種量，轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)菌體，將初始pH值設(shè)定為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定OD560nm。不同初始pH值對菌體OD560nm的影響見圖4。

圖4 初始pH對菌體OD560nm的影響Fig.4 Effect of initial pH on OD560nm

由圖4可知，初始pH值為6.0時(shí)菌體密度最高，經(jīng)方差分析，初始pH6.0與pH5.0、pH5.5條件下的菌體密度差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于pH4.5條件下（P＜0.05）。原因可能是多數(shù)微生物生長適應(yīng)的pH跨度為3～4個(gè)單位，但其最佳生長pH跨度為0.5～1個(gè)單位[11]。酵母菌的生長偏向于在酸性環(huán)境中，因此選擇pH 5.0作為適宜的初始pH。

2.1.5 轉(zhuǎn)速的選擇

在培養(yǎng)基初始pH5.0，培養(yǎng)基裝液量20 mL/100 mL，溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h，6%接種量的條件下培養(yǎng)菌體，將搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min分別進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定OD560nm。不同轉(zhuǎn)速對菌體OD560nm的影響見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)速對菌體OD560nm的影響Fig.5 Effect of rotate speed on cell OD560nm

由圖5可知，菌密度隨著振蕩速度增加而提高，通常在空氣流量一定的情況下，振蕩速度的變化直接影響氧在發(fā)酵液中的傳質(zhì)效率，溶氧是高密度發(fā)酵過程中影響菌體生長的重要因素，溶解氧濃度過高或過低都會(huì)影響微生物的代謝[12-13]，進(jìn)而影響正常的細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物的形成[14]。培養(yǎng)液中的溶氧隨著振蕩速度的增加而增加，有利于菌體生長，但并不是轉(zhuǎn)速越大越好，過高的轉(zhuǎn)速對菌體的剪切力增大，反而不利于菌體的增殖。經(jīng)單因素方差分析，轉(zhuǎn)速150 r/min與180 r/min條件下的菌體密度差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于120 r/min條件下（P＜0.05），因此選擇150 r/min作為適宜的轉(zhuǎn)速。

2.2 酵母發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液pH值、培養(yǎng)時(shí)間、接種量4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采用L9（34）的正交設(shè)計(jì)表，試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2極差分析結(jié)果可知，RC＞RB＞RD＞RA，即溫度對菌體生物量的影響最為顯著，然后依次為初始pH、接種量、培養(yǎng)時(shí)間。發(fā)酵條件的最佳組合為A1B3C1D1，即發(fā)酵時(shí)間36 h、初始pH5.5、溫度26 ℃、接種量4%。以此培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該組合確為該株菌的最適培養(yǎng)條件，在此優(yōu)化條件下培養(yǎng)菌體，其OD560nm為1.370，菌體密度為1.54×108個(gè)/mL，干質(zhì)量可以達(dá)到18.48 g/L，比初始條件下菌體干質(zhì)量提高了約10%。

表1 酵母發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for fermentation condition optimization

表2 酵母發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for fermentation condition optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test result

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，由表3方差分析結(jié)果可知，在試驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間和接種量對菌體生物量的影響差異不顯著（P＞0.05），而初始pH和培養(yǎng)溫度對菌體生物量有顯著影響（P＜0.05）。

3 結(jié)論

采用前期篩選的發(fā)酵培養(yǎng)基來培養(yǎng)釀酒酵母，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考查不同培養(yǎng)條件對菌體生物量的影響，得到的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間36 h、初始pH值為5.5、溫度26 ℃、接種量4%、轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量20mL/100mL，在此優(yōu)化條件下培養(yǎng)菌體，其OD560nm為1.370，密度為1.54×108個(gè)/mL，干質(zhì)量可以達(dá)到18.48 g/L，比初始條件下菌體干質(zhì)量提高了將近10%。

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