徐 艷，丁 靜，孫桂紅，國 駿，紀(jì)明山*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護博士后流動站，遼寧 沈陽 110161；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161）

猴頭菌（Hericium erinaceus）是著名的藥食兼用真菌，具有抗衰老、降血糖、抗菌、抗腫瘤等作用[1-2]。隨著現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的進步，猴頭菌的生產(chǎn)也由田間栽培發(fā)展到液體發(fā)酵生產(chǎn)。研究表明，藥食用真菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖類等含量遠(yuǎn)高于天然或人工栽培的子實體，因此，猴頭菌液體發(fā)酵產(chǎn)物具有重要的研究開發(fā)價值[3]。猴頭菌具有抗氧化作用，其中必含有抗氧化活性物質(zhì)。目前，猴頭菌抗氧化活性的研究主要集中在猴頭多糖上[4-6]，但有研究表明，猴頭菌抗氧化活性與溫度關(guān)系密切。隨著烘烤溫度升高，猴頭菌清除超氧陰離子自由基的能力顯著降低[7]。因此，可以推測出猴頭菌中起抗氧化作用的物質(zhì)除多糖外，還可能有其他活性物質(zhì)，尤其是不耐熱的蛋白類成分。本研究前期試驗也證明了猴頭發(fā)酵菌絲體中，蛋白類成分多種體系的抗氧化活性明顯高于猴頭菌絲多糖[8]。隨著營養(yǎng)學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，多肽類食用安全性更高，且具有極強的活性和多樣性，其抗氧化性相比于蛋白質(zhì)和氨基酸往往更為顯著[9-10]。因此，利用特異的蛋白酶水解，使猴頭發(fā)酵菌絲體蛋白釋放出食源性抗氧化肽有更重要的意義[11]。

本論文以猴頭菌液體發(fā)酵菌絲體為材料，通過反復(fù)凍融法提取其活性蛋白，并以4種蛋白酶水解蛋白獲得蛋白酶解肽，并研究多肽的含量及抗氧化活性，從而篩選最優(yōu)蛋白酶。再利用4因素3水平的正交試驗，將此蛋白酶的水解條件進行優(yōu)化，獲得猴頭菌絲抗氧化肽的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菌（Hericium erinaceus）：購自遼寧省農(nóng)科院；中性蛋白酶（酶活200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活800 000 U/g）、酸性蛋白酶（酶活50000U/g）、堿性蛋白酶（酶活200000U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)（Nitro-Blue tetrazolium chloride，NBT）：上海恒星應(yīng)用化學(xué)研究所；核黃素：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；1,1-二苯-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，純度95%）：A Johnson Matthey Company；牛血清白蛋白對照品：北京奧博星生物技術(shù)有限公司提供，批號為21 060418；福林-酚試劑：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)字恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；TD4A-低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Region-detail-tR-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海科興儀器有限公司；日光燈反應(yīng)箱：自制；DL-CJ-2N超凈工作臺：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；全自動高壓滅菌鍋：SANYO Electric Co.，LTD；HPX-9272MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722S可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菌絲多肽制備工藝流程

（1）培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉25 g，酵母膏25 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH 5.0。培養(yǎng)基均配成1 L，100 mL/瓶分裝于三角瓶中，121 ℃滅菌20 min后置于超凈工作臺冷卻備用。

（2）猴頭菌種子液的制備

在超凈工作臺上將PDA固體斜面培養(yǎng)好的猴頭菌用接種環(huán)取1環(huán)置于種子培養(yǎng)基中，27 ℃搖床中培養(yǎng)，一周后收集種子液。

（3）猴頭菌絲的制備

將培養(yǎng)好的猴頭菌種子液按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，27 ℃搖床中培養(yǎng)，待菌絲生長成熟后將其過濾，水洗后低溫烘干備用。

（4）猴頭菌絲多肽的制備

菌絲蛋白成分的制備：將收集的菌絲干燥后研磨成粉末，取菌絲粉末各2 g于燒杯中，加水20 mL，凍融24 h，離心取上清。

菌絲蛋白酶解肽的制備[12]：用不同的蛋白酶水解猴頭菌絲蛋白。各類酶的水解條件分別為堿性蛋白酶pH值為9.0，55 ℃；中性蛋白酶pH值為7.0，40 ℃；酸性蛋白酶pH值為3.5，40 ℃；木瓜蛋白酶pH值為6，50 ℃；加酶量均為60 U/mL，時間2 h，水解后85 ℃、10 min滅酶，4 000 r/min離心，獲得猴頭菌絲多肽提取液。

1.3.2 猴頭菌絲多肽抗氧化活性的測定

（1）清除超氧自由基活性的測定[13]

采用光照核黃素體系產(chǎn)生超氧自由基。用0.05 mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液為溶劑，配制1.67×10-5mol/L核黃素，0.01 mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蘭（NBT）。分別取上述3種溶液各2.0 mL，加入不同濃度的樣品溶液1.0 mL，空白管以1.0 mL緩沖液代替樣品溶液。置于光照箱中光照20 min，取出后以緩沖溶液為參比于波長560 nm處測定溶液的吸光度值。O-2·清除率按下式計算。

式中：A0為空白管的吸光度值；A樣為樣品管的吸光度值。

（2）清除羥自由基活性的測定[14]

取各樣品液1 mL，加入12 mmol/L水楊酸鈉0.5 mL，0.9 mol/L FeSO40.5 mL，最后加18 mmol/L H2O21 mL啟動反應(yīng)，37 ℃恒溫水浴反應(yīng)1 h后5 000 r/min離心10 min，取上清液并稀釋至10 mL，在波長510 nm處用分光光度計測吸光度值A(chǔ)，根據(jù)以下公式計算·OH的清除率。

式中：A為不加樣品時體系的吸光度值，A1為加入樣品后體系的吸光度值，A2為樣品的本底吸光度值。

（3）清除DPPH·活性的測定[15]

采用提取物與穩(wěn)定自由基DPPH反應(yīng)的分析方法。在同一具塞試管中加入2 mL DPPH溶液（2×10-4mol/L），1 mL不同濃度樣品溶液，搖勻，室溫避光靜置30 min，用無水乙醇作參比在波長517 nm處測定吸光度值A(chǔ)樣品。用1 mL無水乙醇代替樣液，測定空白吸光度值A(chǔ)空白。用2 mL無水乙醇代替DPPH，測定吸光度值A(chǔ)對照。樣品對DPPH·的清除率按下式計算。

（4）還原力的測定[16]

本研究采用鐵離子還原法（FRAP）和鐵氰化鉀還原法來測定各樣品的還原力。具體方法：分別取2.5 mL不同濃度的樣品于試管中，依次加入2.5mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]于50 ℃水浴保溫20 min后，快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL重蒸水，0.5 mL 0.1% FeCl3，充分混勻，靜置10 min，在波長700 nm處測定吸光度值，以重蒸水為陰性對照。以吸光度值表征樣品的還原力，吸光度值越大則樣品的還原能力越強。

1.3.3 菌絲蛋白酶解肽多肽含量測定[17]

牛血清白蛋白對照品溶液：取牛血清白蛋白對照品15.2 mg，加水溶解并定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為0.304 mg/mL，按福林-酚試劑說明進行操作，根據(jù)對照品溶液質(zhì)量濃度與吸光度值關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

供試品溶液的多肽含量測定：取供試品溶液配成濃度梯度，按福林-酚試劑說明進行操作，根據(jù)對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多肽含量。

1.3.4 單因素對菌絲蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影響

在底物濃度不變的情況下，對加酶量、酶解時間、溫度、pH值這4個因素進行單因素影響試驗。

（1）加酶量對菌絲蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影響：用木瓜蛋白酶水解猴頭菌絲蛋白，pH值為6，50 ℃，加酶量分別為40U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL，水解時間2 h，水解后85 ℃、10 min滅酶，4 000 r/min離心，獲得猴頭菌絲多肽提取液。比較還原力和多肽含量，確定加酶量。

（2）酶解時間對菌絲蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影響：同方法（1），酶解時間分別為0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h。比較還原力和多肽含量，確定酶解時間。

（3）溫度對菌絲蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影響：同方法（1），處理溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃。比較還原力和多肽含量，確定水解溫度。

（4）pH值對菌絲蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影響：同方法（1），pH值分別為4、5、6、7、8。比較還原力和多肽含量，確定處理pH值。

1.3.5 正交試驗確定猴頭菌絲抗氧化肽制備的最佳酶解工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以正交試驗確定猴頭菌絲抗氧化肽制備的最佳優(yōu)化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菌絲不同蛋白酶解肽抗氧化活性的測定結(jié)果

不同蛋白酶解肽抗氧化活性的測定結(jié)果見表1。

表1 不同蛋白酶解肽抗氧化活性的測定結(jié)果Table 1 Determination results of antioxidant activity of different enzymatic hydrolysis peptide

2.2 蛋白酶解肽的多肽含量測定

根據(jù)對照品溶液含量及吸收值，可得線性方程y=1.518 1x－0.035 8，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，由線性方程計算各多肽含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polypeptide content

2.3 單因素對菌絲蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影響

單因素對菌絲蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影響見圖2～圖5。

由圖2～圖5可知，加酶量在40～100 U/mL之間，多肽含量及還原力隨著加酶量增加而增大，加酶量大于100 U/mL后多肽含量及還原力的變化不大，故本反應(yīng)體系的最佳加酶量在60～100 U/mL之間；水解時間在0.5～3.0 h之間，多肽含量及還原力隨著水解時間的增加而增加，主要是前期酶活力高，產(chǎn)物的抑制作用小。但當(dāng)水解時間＞3.0 h后多肽含量增幅很小，主要是由于酶解時間的延長，酶活力逐漸下降。故本反應(yīng)體系的最佳水解時間在1.0～3.0 h之間；提取溫度在40～55 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的提高，多肽含量增加及還原力增強，主要是因為溫度的提高使蛋白酶與底物的碰撞機率增加。但提取溫度超過55 ℃以后多肽含量逐漸減小，可能是因為溫度升高使蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成酶活力降低。本試驗條件下，最佳溫度范圍為50～60 ℃；對于pH值，pH值5～7時酶解效果最好。因為木瓜蛋白酶本身也是蛋白質(zhì)，在堿性條件下酶活力會受到影響，而且pH值過大時會產(chǎn)生毒性物質(zhì)，故本反應(yīng)體系的最佳pH值范圍在5～7。

圖2 加酶量對還原力和多肽含量的影響Fig.2 Effect of enzyme addition amount on reducing power and polypeptide content

圖3 水解時間對還原力和多肽含量的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on reducing power and polypeptide content

圖4 溫度對還原力和多肽含量的影響Fig.4 Effect of temperature on reducing power and polypeptide content

圖5 pH值對還原力和多肽含量的影響Fig.5 Effect of pH value on reducing power and polypeptide content

2.4 正交試驗

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，選取木瓜蛋白酶加酶量、酶解時間、溫度、pH值作為4個影響因素，各因素確定3個水平，以還原力和多肽含量為指標(biāo)，進行4因素3水平L9（34）正交試驗，確定最佳工藝參數(shù)。因素水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

從表3可以看出，菌絲多肽含量與抗氧化活性具有一致性，即多肽含量越高，抗氧化活性越強。以還原力為指標(biāo)，考察木瓜蛋白酶各因素對猴頭菌絲抗氧化活性的影響。極差分析結(jié)果表明，加酶量、pH值、水解時間、溫度4個因素對抗氧化活性均有影響，4個因素影響程度的排列順序為：加酶量＞pH值＞水解時間＞溫度。表4方差分析結(jié)果表明，4個因素對抗氧化活性影響均不顯著。根據(jù)正交試驗結(jié)果確定最佳酶解工藝條件為A2B1C2D2，即加酶量80 U/mL，時間1 h，溫度50 ℃，pH 6.0。

表2 猴頭菌絲多肽含量及還原力優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for Hericium erinaceus mycelium polypeptide content and reducing power activity optimization

表3 猴頭菌絲多肽含量及還原力優(yōu)化正交試驗正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Result and analysis of orthogonal test for Hericium erinaceus mycelium polypeptide content and reducing power activity optimization

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test result

2.5 正交試驗的結(jié)果驗證

采用酶解條件：木瓜蛋白酶加酶量80 U/mL，時間1 h，溫度50 ℃，pH6.0，對猴頭菌絲蛋白進行酶解，產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物還原力（OD700nm）為1.035，此時的多肽含量為2.390 mg/g菌絲，即與最優(yōu)組合基本吻合。

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶是水解猴頭菌絲蛋白的最佳酶。加酶量是影響猴頭菌絲抗氧化肽制備的最主要因素。猴頭菌絲抗氧化肽對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基均有良好的清除能力，且呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，有望作為天然抗氧化劑和功能性食品而得到開發(fā)應(yīng)用。

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