蔡東華李 蕾

（1 蘇州市公安局 江蘇 蘇州 215000；2 蘇州市公安局相城分局 江蘇 蘇州 215000）

通過鮮牛奶滯留時間的相關(guān)參數(shù)判斷案發(fā)時間的研究

蔡東華1李 蕾2

（1 蘇州市公安局 江蘇 蘇州 215000；2 蘇州市公安局相城分局 江蘇 蘇州 215000）

采用紫外分光光度法，檢測牛奶中的細(xì)胞含量、糖含量、蛋白質(zhì)含量的變化，同時利用pH試紙測量酸堿變化，得到了4組數(shù)據(jù)和變化曲線。

牛奶 紫外分光光度儀 案發(fā)時間

牛奶變質(zhì)的傳統(tǒng)檢測一般是用生物、化學(xué)的原理來建立一些指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)平皿菌落計數(shù)法、大腸桿菌群乳糖膽鹽發(fā)酵法等。這些方法技術(shù)成熟，容易做出量化的指標(biāo)，但存在操作煩瑣、費時的缺點。近年來，國內(nèi)外檢測牛奶都開始大范圍的使用物理儀器，優(yōu)點是快速、精確。但目前的研究都僅限于單方面的參數(shù)，如R.Tsenkova等人通過近紅外光譜來檢測牛奶中的體細(xì)胞數(shù)；朱亞菲等人利用旋光法測定牛奶中糖的含量。本文在總結(jié)前人對牛奶中各種物質(zhì)檢測和分析所用方法的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)：利用紫外分光光度儀可以同時對牛奶中的細(xì)胞含量、糖含量、蛋白質(zhì)含量的變化進行跟蹤測量。此方法快速、準(zhǔn)確、成本較低，極其適合公安工作。

1 實驗材料與方法

1.1 樣品

用蒙牛特侖蘇盒裝純牛奶進行實驗。選取牛奶全部為同一批次。選擇日期為實驗前1天生產(chǎn)的新鮮牛奶。實驗前1天，準(zhǔn)備22個燒杯，7天實驗，每天3個樣本，共21個燒杯都倒上40mL的牛奶，編號為1.1，1.2，1.3，……7.1，7.2，7.3。第22個燒杯為空白樣本，倒?jié)M，編號為0。為保證實驗條件的一致，將1-21號燒杯至于恒溫恒濕箱內(nèi)，模仿夏日條件，設(shè)溫度為30℃，濕度為80℃。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)的UV-2600型紫外可見分光光度儀；上海躍進醫(yī)療器械廠產(chǎn)的LRHS-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱；上?？等A生化儀器制造有限公司 HS-6001超級恒溫水浴箱；德國eppendorf公司產(chǎn)的5804R離心機。

試劑：磷酸、無菌水、100ug/mL的酪氨酸溶液、0.9%的NaCl溶液、DNS試劑、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、酒精。

1.3 方法

1.3.1 波長的選擇

本實驗選用紫外分光光度計進行測量，測量時選用的吸收波長關(guān)乎著實驗結(jié)果是否準(zhǔn)確，因此，必須先用樣品牛奶進行吸收波長的預(yù)實驗，即當(dāng)牛奶中需要測量的物質(zhì)出現(xiàn)最強吸收峰時，峰值對應(yīng)的波長便為最佳波長。細(xì)胞、糖、蛋白質(zhì)的最佳波長分別為600nm，540nm，280nm。

1.3.2 測定牛奶中的細(xì)胞含量

設(shè)定波長為600nm，第1天在樣本0和樣本1.1，1.2，1.3（第2天重復(fù)第1天操作，在出現(xiàn)固體的時候取上清液）中分別取2mL牛奶注入比色皿中。用空白樣調(diào)零，再依次放入1.1，1.2，1.3號樣本，測量，記錄OD值，并通過公式1/108=OD/X（X為細(xì)胞含量）來計算該樣本中的細(xì)胞含量。3份樣本分別測完后取平均值，并繪制變化曲線。

1.3.3 測定牛奶中的糖含量

第一步制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取離心管，按表1配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制

將各離心管搖勻，在沸水浴中加熱5min后冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至2.5mL。設(shè)紫波長為540nm，用0號管調(diào)零點，測出1-6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，得出線性回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

第二步牛奶樣品中還原糖的提取。樣品組按磷酸0.25mL，無菌水 1.05mL，待測樣品 （牛奶）0.2mL，37℃水浴30min，DNS2.5mL，沸水浴10min，流水冷卻3min，離心1000rpm，4℃，10min，取上清液2mL測定OD值（540nm）的順序添加和操作。空白組按磷酸0.25mL，無菌水1.05mL，空白樣品（蒸餾水）0.2mL，加2.5mLDNS，37℃水浴30min，沸水浴 10min，流水冷卻 3min，離心 1000rpm，4℃，10min，取上清液2mL測定OD值（540nm）的順序添加和操作。

第三步測量。用空白組調(diào)零后，在540nm的波長下測定1.1，1.2，1.3號樣本的OD值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用公式：

便可求出牛奶中的總糖含量，以時間為橫坐標(biāo)，總糖含量的變化為縱坐標(biāo)繪制牛奶中糖含量的變化曲線。

1.3.4 測定牛奶中的蛋白質(zhì)含量

第一步用酪蛋白配置蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。取試管，按表2配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。

表2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液配制

將各試管搖勻。設(shè)波長為280nm，用0號管調(diào)零點，測出1-5號管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，得出線性回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

第二步，配取待測液。將每份牛奶稀釋10倍，取稀釋后的待檢液2mL，用0.9%的NaCl溶液定容至10mL，在280nm的波長下測定1.1，1.2，1.3號樣本的OD值。取平均值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用公式：

來計算牛奶中的實際蛋白質(zhì)濃度，并以時間為橫坐標(biāo)，牛奶中實際蛋白質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)繪制蛋白含量的變化曲線。

1.3.5 測定牛奶的酸堿變化

利用pH試紙，試紙保持干燥，放入溶液半分鐘后取出與標(biāo)準(zhǔn)樣板比較。得出溶液的pH值，記錄并繪制變化曲線。

2 結(jié)果

實驗結(jié)果，如圖4-圖7（單位：×107個/mL）。

圖3 牛奶中細(xì)胞含量隨時間變化曲線圖

圖4 牛奶中糖含量隨時間變化曲線圖

圖5 牛奶中蛋白含量隨時間變化曲線圖

圖6 牛奶pH值隨時間變化的曲線圖

從圖中可以看出4項參數(shù)的變化趨勢。牛奶中的細(xì)胞含量會隨著時間的推移先上升，經(jīng)歷過一段平穩(wěn)期后再逐漸下降。牛奶中的糖含量和蛋白質(zhì)含量都會隨著時間逐漸下降。牛奶的pH值會隨著時間的推移越來越小，即牛奶會越來越酸，但下降到一定程度趨于平穩(wěn)后，就不再下降。

3 討論

細(xì)胞含量出現(xiàn)以上變化是因為牛奶中富含微生物繁殖所需的營養(yǎng)，微生物很容易繁殖。鮮牛奶中一旦有細(xì)菌開始滋生繁殖，其中的各種養(yǎng)分在這些微生物的作用下就會發(fā)生一系列變化。而細(xì)菌本身的繁殖變化就具有一定的規(guī)律，分為4個階段，第1階段為遲緩期。即細(xì)菌的適應(yīng)期，所以繁殖較少。第2階段為對數(shù)期。此期活菌數(shù)直線上升，可因不同的條件持續(xù)幾小時至幾天不等。第3階段為穩(wěn)定期。該期的生長菌群總數(shù)處于平坦階段。但由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性產(chǎn)物積累，pH下降等不利因素，細(xì)菌繁殖速度漸趨下降。第4階段為衰亡期。隨著穩(wěn)定期的發(fā)展，細(xì)菌繁殖越來越慢直至逐漸死亡?？梢娕Ｄ讨屑?xì)胞的變化規(guī)律與此基本相符。

糖含量出現(xiàn)以上變化是因為牛奶中的絕大部分細(xì)菌都含有能分解乳糖的酶。例如：乳糖桿菌中含有乳糖酶，可將乳糖分解為D-(+)-葡萄糖和D-(+)-半乳糖；這些單糖隨即又被其他的酶轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?6-磷酸酯，后者又依次被其他8種酶、經(jīng)過10個反應(yīng)轉(zhuǎn)化為丙酮酸。所以隨著時間的增長，牛奶中的糖含量會越來越少。

蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)以上變化是因為蛋白質(zhì)的微生物降解反應(yīng)。蛋白質(zhì)被牛奶中細(xì)菌的酶分解為各種氨基酸的混合物，這些氨基酸又進一步被分解為各種有機酸、醛、醇和其他無機小分子物質(zhì)。反應(yīng)的主要機理是各種氨基酸先被氧化脫氨再脫羧。所以隨著時間的增長，牛奶中的蛋白含量會越來越少。

pH值的變化主要是因為乳酸的產(chǎn)生。隨著乳酸的生成，牛奶的pH不斷下降，雖然細(xì)菌的繁殖使牛奶的pH降低且出現(xiàn)凝結(jié)現(xiàn)象，但牛奶中的細(xì)菌并不喜歡酸性環(huán)境。低pH的酸性環(huán)境抑制了細(xì)菌的繁殖，因此下降到一定程度時就不會再下降，也不會再產(chǎn)生乳酸了。

本方法優(yōu)點，利用檢測儀器，能檢測到不同溫度，不同濕度，不同品牌的牛奶中這4組數(shù)據(jù)的變化，并以此可以建立一個完備的數(shù)據(jù)庫。一旦現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)開封牛奶，經(jīng)過對其中4組參數(shù)的測量，再與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行對比，就能作為一個很好的輔助手段幫助我們反推牛奶的開封時間，進而在缺少能準(zhǔn)確判斷案發(fā)時間條件的情況下，幫助我們判斷案發(fā)時間。該方法簡便、客觀、微量、準(zhǔn)確。

但是，該種方法也具有一定的局限，首先，4組數(shù)據(jù)需要一起運用，單獨一組可能會出現(xiàn)誤差。其次，判斷的時間有限，時間過長后牛奶中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，牛奶中的這4項指標(biāo)都會失去參考價值；再次，細(xì)菌種群對牛奶的影響；最后，要建立成一個完備的數(shù)據(jù)庫還需要大量的實驗。

[1]劉毅萍，何建平.平皿菌落計數(shù)法檢測便攜式紫外線滅菌燈的滅菌效果[J].安徽醫(yī)藥，2005，(7).

[2]張勇，劉衡川，周海濤，等.冷凍損傷大腸菌群在乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基生長狀況[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2009，(6).

[3]R.Tsenkova，S.Atanassova，K.Itoh，etal Near infrared spectroscopy for biomonitoring： Cow milk compositionmeasurementinaspectralregionfrom1，100to 2，400nanometersl[J].AnimalScienceJournal.2000(4)，23(2).

[4]朱亞菲，吳俊林.用旋光法測定牛奶中糖的含量[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版）.2006，34(6).

[5]湯偉，王明偉，董文賓，等.牛奶主要營養(yǎng)成分的數(shù)學(xué)模型[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報，2005，(23).

[6]陳士運，沈旭，苗立中，等.應(yīng)用紫外分光光度法進行禽多殺性巴氏桿菌(C48-1)細(xì)菌計數(shù)的研究[J].山東畜牧獸醫(yī)，2009，(5).

[7]夏金嬋，苗雨晨，宋純鵬，等.紫外分光光度技術(shù)測定植物細(xì)胞中H2O2的含量[J].四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，42(6).

[8]楊貴明，蔣愛華，薛秋生.用DNS光度法測定還原糖的條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(14).

[9]王俊麗，聶國興，李素貞，等.DNS法測定還原糖含量時最適波長的確定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(4).

[10]曹紅翠.紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)的含量[J].廣東化工，2007，34(8).

[11]高莉萍，盛鳳仙，浦奕奕，等.紫外分光光度法快速測定人纖維蛋白原制品中蛋白質(zhì)含量[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，24(1).

[12]張華，夏占強，葉萍，等.紫外分光光度法快速測定纖維蛋白粘合劑中蛋白質(zhì)含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8(8).

[13]田志梅，張永順.紫外分光光度法快速測定液體奶、奶粉中蛋白質(zhì)含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(2).

（責(zé)任編輯：于 萍）

D918.92

A

2013-12-1

蔡東華（1989-），男，江蘇鹽城人，蘇州市公安局民警，學(xué)士。