董蜀斌　王斌全

【摘要】 目的：探討自噬基因Beclin1在喉鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)77例喉鱗癌組織和22例正常組織中Beclin1的表達(dá)，分析Beclin1的表達(dá)與喉鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系。結(jié)果：Beclin1表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，與正常組織比較，喉鱗癌組織中Beclin1的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低（P<0.05）；Beclin1表達(dá)與喉癌的臨床分型無(wú)關(guān)（P>0.05），與喉癌的T分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：Beclin1表達(dá)缺失可能是喉鱗癌形成過(guò)程中的重要機(jī)制之一，可能成為探討腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移研究的新靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 喉鱗癌； Beclin1； 免疫組織化學(xué)

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著患者的健康，其組織來(lái)源于喉黏膜上皮組織，最常見(jiàn)的喉癌為喉鱗狀細(xì)胞癌[1-2]。自噬可以清除損傷組織，減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，降低突變率，抑制腫瘤的形成，而自噬的缺陷與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[3]。Beclin1基因位于人染色體17q21，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的自噬基因，在多種腫瘤中表現(xiàn)為表達(dá)降低和缺失，Beclin1表達(dá)缺失明顯增加肝癌、肺癌和淋巴瘤的發(fā)生率，但自噬基因Beclin1的表達(dá)與喉癌的關(guān)系尚不清楚[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)喉鱗癌患者組織中自噬基因Beclin1的表達(dá)，探討自噬基因Beclin1與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來(lái)源 喉鱗癌標(biāo)本由山西省腫瘤醫(yī)院提供，共收集2005年1月-2007年12月行手術(shù)切除和病理確診的77例喉鱗癌患者組織。其中男71例，女6例。年齡41～79歲，平均59.3歲。40例聲門上型患者，30例聲門型，6例聲門下型，1例臨床分型不確定。病理分類：5例高分化鱗癌，64例中分化鱗癌，8例低分化鱗癌。4例T1期患者，26例T2期患者，31例T3期患者，11例T4期患者，5例T分期不確定。15例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，62例患者無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，納入患者確診時(shí)均無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所有患者手術(shù)前未經(jīng)化療和放療，經(jīng)病理檢查均確認(rèn)為鱗狀細(xì)胞癌。手術(shù)切除的標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片厚度4 μm 3張，對(duì)各1張組織切片進(jìn)行HE、免疫組織化學(xué)染色、1張備用。另外選取22例正常喉組織，其中男20例，女2例，年齡44～75歲，平均58.5歲。兩種組織標(biāo)本一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑 Beclin1和p-PKB為多克隆兔抗人抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司，多克隆兔抗人p110α及hvps34抗體購(gòu)自Abgent公司。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素試劑盒和DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 免疫組化采用S-P法，依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。Beclin1稀釋倍數(shù)為1∶20。結(jié)果的判斷所有切片采用盲法由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果采用兩種方法：（1）染色結(jié)果判定：每例標(biāo)本以400倍光鏡下隨意選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)求其陽(yáng)性百分率作為結(jié)果。平均陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<5%為陰性，>5%判定為陽(yáng)性。（2）在×100下觀察全片，選擇5個(gè)陽(yáng)性物質(zhì)豐富的視野，然后采用Image-Pro Plus 4.5分析軟件在×400下測(cè)定陽(yáng)性物質(zhì)的積分光密度值（integrated optical density，IOD），計(jì)算平均IOD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，理論頻數(shù)小于5時(shí)采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1在喉癌組織中的表達(dá) Beclin1表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，染色陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色，Beclin1在正常喉組織中的表達(dá)較高，在喉癌中的表達(dá)減少，見(jiàn)圖1～4。

2.2 喉癌和正常喉組織Beclin1蛋白表達(dá)比較 與正常喉組織組比較，喉癌組中Beclin1表達(dá)的陽(yáng)性率及量均明顯降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3 喉癌中Beclin1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在臨床分型中，喉癌聲門上型、聲門型、聲門下型三組中Beclin1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在組織學(xué)分化分組中，與低分化的喉癌比較，Beclin1在高、中分化的喉癌組織中的量及陽(yáng)性率均明顯增高表達(dá)（P<0.05）；在T期分組中，T1+T2中Beclin1蛋白表達(dá)量及陽(yáng)性率均顯著高于T3+T4組（P<0.05）；在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中Beclin1的表達(dá)量及陽(yáng)性率均明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P<0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

自噬（autophagy）是將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體為特征的細(xì)胞自我消化過(guò)程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。同時(shí)自噬還參與多種疾病的病理過(guò)程。最近的研究表明細(xì)胞自噬是腫瘤細(xì)胞逃避凋亡的一種重要機(jī)制，自噬活性的異常與腫瘤的發(fā)生有著直接的關(guān)系[3]。喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年發(fā)病有上升趨勢(shì)，并且位置特殊、解剖復(fù)雜、功能重要、治療復(fù)雜[4]。因此，研究自噬與喉癌的關(guān)系對(duì)喉癌進(jìn)一步診治有重要意義，筆者的研究就是在臨床上進(jìn)一步觀察自噬基因Beclin1的表達(dá)與喉癌的關(guān)系。

Beclin1是哺乳動(dòng)物參與自噬的雙等位抑癌基因，位于染色體17q21[5]。Aita等[4]發(fā)現(xiàn)22株乳腺癌細(xì)胞株中有9株存在Beclin1的等位基因缺陷，進(jìn)而認(rèn)為Beclin1為一腫瘤抑制基因。Liang等[6]發(fā)現(xiàn)在11種人乳腺癌細(xì)胞株中有8種細(xì)胞株Beclin1蛋白表達(dá)缺失，通過(guò)蛋白印跡對(duì)17例乳腺癌標(biāo)本的Beclin1蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)15例Beclin1蛋白表達(dá)降低，而用免疫組化檢測(cè)32例乳腺癌樣本有18例Beclin1蛋白明顯下調(diào)，證實(shí)了乳腺癌中存在Beclin1蛋白表達(dá)的特異性缺失，因此Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)在人乳腺癌中是常見(jiàn)的現(xiàn)象。自噬基因Beclin-1為雜合子的小鼠發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增高；乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌患者Beclin-1等位基因缺失的比例高于健康人。筆者的研究采用免疫組化SP法對(duì)77例喉癌、22例正常喉組織中Beclin1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：該基因主要表達(dá)在正常喉組織細(xì)胞以及癌細(xì)胞中，間質(zhì)中表達(dá)少見(jiàn)，在喉癌中的表達(dá)明顯低于正常喉組織中的表達(dá)，提示自噬基因Beclin1在喉癌中表達(dá)下調(diào)[7-8]。endprint

自噬不僅在調(diào)控腫瘤的生成有重要的作用，并且與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在臨床上，腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素是喉癌惡性程度以及預(yù)后的重要指標(biāo)[9-10]?；颊吲R床分期越晚，組織學(xué)分化越差，其侵襲與轉(zhuǎn)移能力也越強(qiáng)，預(yù)后越差[11]。本研究發(fā)現(xiàn)Beclin1的蛋白表達(dá)與喉癌的臨床分型無(wú)相關(guān)性，但是T1+T2中Beclin1蛋白表達(dá)高于T3+T4組，表明Beclin1的蛋白表達(dá)與喉癌的T分期有顯著相關(guān)性，表明Beclin1的表達(dá)與喉癌的臨床進(jìn)展有關(guān)。在不同分化喉癌組的比較中，高、中分化組與低分化組的比較時(shí)，Beclin1表達(dá)明顯增高，表明腫瘤細(xì)胞分化程度越低，惡性程度越高，自噬能力也減弱地更加明顯，提示Beclin1表達(dá)降低和喉癌的預(yù)后相關(guān)。喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其重要轉(zhuǎn)移途徑，本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組相比，Beclin1表達(dá)降低，提示Beclin1表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究表明，自噬可能是抑制腫瘤血管形成和分布的一種方式[12]。

綜上所述，自噬基因Beclin1在喉癌中的表達(dá)明顯低于正常喉組織，Beclin1的缺失與喉癌的發(fā)生有關(guān)。自噬基因Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率與喉癌的T分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，當(dāng)Beclin1表達(dá)下調(diào)時(shí)腫瘤的惡性程度更高，更容易發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究自噬基因Beclin1對(duì)喉癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，對(duì)進(jìn)一步探索喉癌的治療有積極意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Woodard T D，Oplatek A，Petruzzelli G J.Life after total laryngectomy：a measure of long-term survival，function，and quality of life[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2007，133（6）：526-532.

[2] Chu E A，Kim Y J.Laryngeal cancer：diagnosis and preoperative work-up[J].Otolaryngol Clin North Am，2008，41（4）：673-695.

[3] Lockshin R A，Zakeri Z.Apoptosis，autophagy，and more[J].Int J Biochem Cell Biol，2004，36（12）：2405-2419.

[4] Aita V M，Liang X H，Murty V，et al.Cloning and genomic organization of Beclin1，a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[J].Genomics，1999，59（1）：59-65.

[5] Xia P，Wang S，Du Y，et al.WASH inhibits autophagy through suppression of Beclin1 ubiquitination[J].EMBO J，2013，32（20）：2685-2696.

[6] Liang X H，Jackson S，Seaman M，et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[J].Nature，1999，402（6762）：672-676.

[7] Qu X，Yu J，Bhagat G，et al.Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin1 autophagy gene[J].J Clin Invest，2003，112（12）：1809-1820.

[8] Yue Z，Jin S，Yang C，et al.Beclin1，an autophagy gene essential for early embryonic development，is a haploinsufficient tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci，2003，100（25）：15077-15082.

[9] Richard J M，Sancho-Garnier H，Pessey J J，et al.Randomized trial of induction chemotherapy in larynx carcinoma[J].Oral Oncol，1998，34（3）：224-228.

[10] Cohen S M，Garrett C G，Dupont W D，et al.Voice-related quality of life in T1 glottic cancer：irradiation versus endoscopic excision[J].Ann Otol Rhinol Laryngol，2006，115（8）：581-586.

[11] Lin H X，Qiu H J，Zeng F，et al.Decreased expression of Beclin1 correlates closely with Bcl-xL expression and poor prognosis of ovarian carcinoma[J].PloS one，2013，8（4）：e60516.

[12] Chau Y P，Lin S Y，Chen J H C，et al.Endostatin induces autophagic cell death in EAhy926 human endothelial cells[J].Histol Histopathol，2003，18（3）：715-726.

（收稿日期：2013-11-25） （本文編輯：歐麗）endprint

自噬不僅在調(diào)控腫瘤的生成有重要的作用，并且與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在臨床上，腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素是喉癌惡性程度以及預(yù)后的重要指標(biāo)[9-10]。患者臨床分期越晚，組織學(xué)分化越差，其侵襲與轉(zhuǎn)移能力也越強(qiáng)，預(yù)后越差[11]。本研究發(fā)現(xiàn)Beclin1的蛋白表達(dá)與喉癌的臨床分型無(wú)相關(guān)性，但是T1+T2中Beclin1蛋白表達(dá)高于T3+T4組，表明Beclin1的蛋白表達(dá)與喉癌的T分期有顯著相關(guān)性，表明Beclin1的表達(dá)與喉癌的臨床進(jìn)展有關(guān)。在不同分化喉癌組的比較中，高、中分化組與低分化組的比較時(shí)，Beclin1表達(dá)明顯增高，表明腫瘤細(xì)胞分化程度越低，惡性程度越高，自噬能力也減弱地更加明顯，提示Beclin1表達(dá)降低和喉癌的預(yù)后相關(guān)。喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其重要轉(zhuǎn)移途徑，本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組相比，Beclin1表達(dá)降低，提示Beclin1表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究表明，自噬可能是抑制腫瘤血管形成和分布的一種方式[12]。

綜上所述，自噬基因Beclin1在喉癌中的表達(dá)明顯低于正常喉組織，Beclin1的缺失與喉癌的發(fā)生有關(guān)。自噬基因Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率與喉癌的T分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，當(dāng)Beclin1表達(dá)下調(diào)時(shí)腫瘤的惡性程度更高，更容易發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究自噬基因Beclin1對(duì)喉癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，對(duì)進(jìn)一步探索喉癌的治療有積極意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Woodard T D，Oplatek A，Petruzzelli G J.Life after total laryngectomy：a measure of long-term survival，function，and quality of life[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2007，133（6）：526-532.

[2] Chu E A，Kim Y J.Laryngeal cancer：diagnosis and preoperative work-up[J].Otolaryngol Clin North Am，2008，41（4）：673-695.

[3] Lockshin R A，Zakeri Z.Apoptosis，autophagy，and more[J].Int J Biochem Cell Biol，2004，36（12）：2405-2419.

[4] Aita V M，Liang X H，Murty V，et al.Cloning and genomic organization of Beclin1，a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[J].Genomics，1999，59（1）：59-65.

[5] Xia P，Wang S，Du Y，et al.WASH inhibits autophagy through suppression of Beclin1 ubiquitination[J].EMBO J，2013，32（20）：2685-2696.

[6] Liang X H，Jackson S，Seaman M，et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[J].Nature，1999，402（6762）：672-676.

[7] Qu X，Yu J，Bhagat G，et al.Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin1 autophagy gene[J].J Clin Invest，2003，112（12）：1809-1820.

[8] Yue Z，Jin S，Yang C，et al.Beclin1，an autophagy gene essential for early embryonic development，is a haploinsufficient tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci，2003，100（25）：15077-15082.

[9] Richard J M，Sancho-Garnier H，Pessey J J，et al.Randomized trial of induction chemotherapy in larynx carcinoma[J].Oral Oncol，1998，34（3）：224-228.

[10] Cohen S M，Garrett C G，Dupont W D，et al.Voice-related quality of life in T1 glottic cancer：irradiation versus endoscopic excision[J].Ann Otol Rhinol Laryngol，2006，115（8）：581-586.

[11] Lin H X，Qiu H J，Zeng F，et al.Decreased expression of Beclin1 correlates closely with Bcl-xL expression and poor prognosis of ovarian carcinoma[J].PloS one，2013，8（4）：e60516.

[12] Chau Y P，Lin S Y，Chen J H C，et al.Endostatin induces autophagic cell death in EAhy926 human endothelial cells[J].Histol Histopathol，2003，18（3）：715-726.

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自噬不僅在調(diào)控腫瘤的生成有重要的作用，并且與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在臨床上，腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素是喉癌惡性程度以及預(yù)后的重要指標(biāo)[9-10]?；颊吲R床分期越晚，組織學(xué)分化越差，其侵襲與轉(zhuǎn)移能力也越強(qiáng)，預(yù)后越差[11]。本研究發(fā)現(xiàn)Beclin1的蛋白表達(dá)與喉癌的臨床分型無(wú)相關(guān)性，但是T1+T2中Beclin1蛋白表達(dá)高于T3+T4組，表明Beclin1的蛋白表達(dá)與喉癌的T分期有顯著相關(guān)性，表明Beclin1的表達(dá)與喉癌的臨床進(jìn)展有關(guān)。在不同分化喉癌組的比較中，高、中分化組與低分化組的比較時(shí)，Beclin1表達(dá)明顯增高，表明腫瘤細(xì)胞分化程度越低，惡性程度越高，自噬能力也減弱地更加明顯，提示Beclin1表達(dá)降低和喉癌的預(yù)后相關(guān)。喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其重要轉(zhuǎn)移途徑，本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組相比，Beclin1表達(dá)降低，提示Beclin1表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究表明，自噬可能是抑制腫瘤血管形成和分布的一種方式[12]。

綜上所述，自噬基因Beclin1在喉癌中的表達(dá)明顯低于正常喉組織，Beclin1的缺失與喉癌的發(fā)生有關(guān)。自噬基因Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率與喉癌的T分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，當(dāng)Beclin1表達(dá)下調(diào)時(shí)腫瘤的惡性程度更高，更容易發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究自噬基因Beclin1對(duì)喉癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，對(duì)進(jìn)一步探索喉癌的治療有積極意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Woodard T D，Oplatek A，Petruzzelli G J.Life after total laryngectomy：a measure of long-term survival，function，and quality of life[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2007，133（6）：526-532.

[2] Chu E A，Kim Y J.Laryngeal cancer：diagnosis and preoperative work-up[J].Otolaryngol Clin North Am，2008，41（4）：673-695.

[3] Lockshin R A，Zakeri Z.Apoptosis，autophagy，and more[J].Int J Biochem Cell Biol，2004，36（12）：2405-2419.

[4] Aita V M，Liang X H，Murty V，et al.Cloning and genomic organization of Beclin1，a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[J].Genomics，1999，59（1）：59-65.

[5] Xia P，Wang S，Du Y，et al.WASH inhibits autophagy through suppression of Beclin1 ubiquitination[J].EMBO J，2013，32（20）：2685-2696.

[6] Liang X H，Jackson S，Seaman M，et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[J].Nature，1999，402（6762）：672-676.

[7] Qu X，Yu J，Bhagat G，et al.Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin1 autophagy gene[J].J Clin Invest，2003，112（12）：1809-1820.

[8] Yue Z，Jin S，Yang C，et al.Beclin1，an autophagy gene essential for early embryonic development，is a haploinsufficient tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci，2003，100（25）：15077-15082.

[9] Richard J M，Sancho-Garnier H，Pessey J J，et al.Randomized trial of induction chemotherapy in larynx carcinoma[J].Oral Oncol，1998，34（3）：224-228.

[10] Cohen S M，Garrett C G，Dupont W D，et al.Voice-related quality of life in T1 glottic cancer：irradiation versus endoscopic excision[J].Ann Otol Rhinol Laryngol，2006，115（8）：581-586.

[11] Lin H X，Qiu H J，Zeng F，et al.Decreased expression of Beclin1 correlates closely with Bcl-xL expression and poor prognosis of ovarian carcinoma[J].PloS one，2013，8（4）：e60516.

[12] Chau Y P，Lin S Y，Chen J H C，et al.Endostatin induces autophagic cell death in EAhy926 human endothelial cells[J].Histol Histopathol，2003，18（3）：715-726.

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