徐沂春，胡紹慶，趙宏波

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300；2.浙江理工大學(xué)建筑工程學(xué)院，浙江杭州 310018；3.浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江臨安 311300）

基于AFLP分子標(biāo)記的不同類型野生桂花種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

徐沂春1，胡紹慶2，趙宏波3

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300；2.浙江理工大學(xué)建筑工程學(xué)院，浙江杭州 310018；3.浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江臨安 311300）

桂花Osmanthus fragrans具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。研究野生桂花種群的遺傳多樣性有利于為新品種的選育以及野生桂花資源的保護(hù)提供重要的依據(jù)。利用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)對(duì)江西全南（衰退型）和福建長汀（穩(wěn)定型）這2個(gè)桂花自然種群96個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性評(píng)估。7對(duì)引物組合共檢測到330個(gè)清晰位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)276個(gè)，占83.64%。在物種水平，桂花的Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）為0.428 3，Nei’s基因多樣性（He）為0.285 6，表明桂花具有豐富的遺傳多樣性；在種群水平，福建長汀種群的多態(tài)性指數(shù)均高于江西全南種群，表明包含不同世代、具有較好自然更新能力的長汀種群攜帶更豐富的遺傳信息；分子方差分析（AMOVA）表明：桂花的遺傳變異主要存在于種群內(nèi)（71%），種群間的遺傳變異只占29%；2個(gè)種群間存在一定的遺傳分化（Gst=0.161 6），種群間基因流較小（Nm=2.594 9）。圖2表4參23

植物學(xué)；桂花；野生種群；擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

桂花Osmanthus fragrans屬木犀科Oleaceae木犀屬Osmanthus，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。目前，桂花在中國南嶺以北至秦嶺以南的廣大亞熱帶地區(qū)均有大量應(yīng)用，其栽培面積和栽植數(shù)量是中國園林苗木中最大的種類之一。隨著2004年中國取得了桂花國際登錄權(quán)，進(jìn)一步拓展了桂花生產(chǎn)和銷售的國際和國內(nèi)市場，這就要求我們必須進(jìn)行桂花種質(zhì)的改良和創(chuàng)新，培育花大、芳香、色艷、抗性強(qiáng)的桂花新品種。野生桂花具豐富的性狀變異和遺傳變異，是栽培桂花的重要育種資源，然而野生資源開發(fā)過度，破壞嚴(yán)重，適生生境散失，分布范圍急劇縮小，種群規(guī)模和數(shù)量銳減；而現(xiàn)存的野生桂花種群僅在湖南[1-3]、福建[4]、浙江[3，5]、江西[6]等地被零星發(fā)現(xiàn)。目前，野生桂花資源的研究主要集中在野生資源的調(diào)查[3，6]、種群動(dòng)態(tài)[1，4]、繁育系統(tǒng)[2，5]等方面，而遺傳多樣性等方面的研究報(bào)道較少。江西全南和福建長汀的2個(gè)桂花自然種群保存較好，隔離分布，具有代表性。本研究利用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)2個(gè)不同類型（衰退型和穩(wěn)定型）野生桂花種群遺傳多樣性進(jìn)行分析，從而明確這2個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)，為桂花野生資源的科學(xué)保護(hù)和有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象為江西全南和福建長汀的2個(gè)桂花自然種群。前者位于江西省贛州市全南縣，地理位置24.728°N，114.427°E，海拔約為342 m，為南嶺北端，屬中亞熱帶季風(fēng)型氣候，年平均氣溫為18.8℃；此處為一風(fēng)水林，面積較小，僅有23株成齡桂花組成，地徑大小為8～45 cm；林下無種子幼苗和天然壓條形成的小苗，無自然更新能力，屬于衰退型種群。后者位于福建省龍巖市長汀縣，地理位置25.543°N，116.533°E，海拔約479 m，為武夷山脈南段，屬中亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，年均氣溫18.7℃；此處為一孤島，主要由石灰?guī)r構(gòu)成，面積較大，以灌木型和小喬木型桂花組成；灌木型桂花主要位于較低海拔區(qū)且土層較薄，小喬木型桂花處于地勢較平坦處且土層相對(duì)較厚；林下存在較多天然更新幼苗，屬于穩(wěn)定型種群。江西全南共有23份樣本，全部采集，所有材料地徑均大于8 cm；福建長汀共采集73份樣本，采集的材料地徑均大于3 cm，相互間隔大于2m。將采集的新鮮葉片放入硅膠干燥后帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和AFLP分析本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取桂花基因組DNA，并用NanoDrop微量分光光度計(jì)（ND-1000）和8.0 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳（六一電泳儀）檢測總DNA的濃度與純度，于-70℃保存?zhèn)溆?。采用EcoR I和Mse I雙酶切組合以及從生工生物工程（上海）股份有限公司合成的64對(duì)引物中篩選出的7對(duì)引物組合進(jìn)行AFLP分析?；静襟E如下：①酶切：300 ng DNA模板，50 nkat Eco R I，50 nkat Mse I，1×NEB緩沖液4，3μg牛血清白蛋白（BSA），補(bǔ)足雙蒸水至30μL。37℃恒溫4 h，反應(yīng)結(jié)束后75℃水浴15 min使酶失活。②連接：66.7 nkat T4 DNA ligast，1× T4 DNA緩沖液，20 pmol E1-E2接頭，20 pmol M1-M2接頭，酶切產(chǎn)物10μL，補(bǔ)足雙蒸水至20μL。16℃恒溫10 h以上。③預(yù)擴(kuò)增：1μL連接產(chǎn)物，16.7 nkat Taq，1×緩沖液，4 nmol三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP），6 pmol EcoRⅠ預(yù)擴(kuò)增引物，6 pmol MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物，補(bǔ)足雙蒸水至20μL。反應(yīng)條件為94℃，5 min；94℃，30 s，56℃，1 min，72℃，1 min，共25個(gè)循環(huán)；72℃10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍，作為選擇性擴(kuò)增模板。④選擇性擴(kuò)增：預(yù)擴(kuò)增釋稀產(chǎn)物4μL，16.7 nkat Taq，1×緩沖液，4 nmol dNTP，6 pmol EcoRⅠ選擇性引物，6 pmol MseⅠ選擇性引物，補(bǔ)足雙蒸水至20μL。反應(yīng)條件為：94℃，5min；94℃，30 s，65℃，30 s，72℃，1min，共13循環(huán)（每循環(huán)降0.7℃）；94℃，30 s，56℃，30 s，72℃，1 min，共25循環(huán)；72℃，7 min。擴(kuò)增在Bio-RAD S1000TM Thermal Cycler PCR儀中進(jìn)行。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物用60.0 g·L-1變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（Sequi-GenGT核酸測序電泳系統(tǒng)）。60W恒功率預(yù)電泳30 min；6μL選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL上樣緩沖液[體積分?jǐn)?shù)為98%甲酰胺，10 mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%二甲苯青FF，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%溴酚藍(lán)]混合，94℃變性5min，結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣；加樣7μL·泳道-1，70W恒功率電泳，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結(jié)束電泳；弱堿法銀染顯影，用Canon D60拍照保存圖像。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析記錄長度在500 bp以下清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增帶，用“1-0”系統(tǒng)記錄譜帶，有條帶的記為1，無條帶的記為0，構(gòu)成表型數(shù)據(jù)矩陣。AFLP分子標(biāo)記為顯性標(biāo)記，因此假設(shè)分析的各位點(diǎn)都處于Hardy-Weinberg平衡。應(yīng)用Popgen version 1.32軟件[7]分別為多態(tài)條帶百分率（PPB），觀測等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne），Nei，s基因多樣性指數(shù)（He），Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I），物種的基因多樣性（Ht），種群內(nèi)的基因多樣性（Hs）和種群間的遺傳分化系數(shù)（Gst），基因流[Nm=0.5（1-Gst）/Gst]等遺傳多樣性參數(shù)。用GenAlex 6.5軟件[8]進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）進(jìn)行，計(jì)算物種的遺傳變異以及遺傳分化系數(shù)（PhiPT）以揭示群體遺傳分量；用NTSYS-pc 2.10e軟件[9]對(duì)個(gè)體進(jìn)行非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）聚類分析，估測群體遺傳結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP選擇性擴(kuò)增結(jié)果

從64對(duì)引物組合中篩選出了7對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高且分辨能力強(qiáng)的引物組合，對(duì)2個(gè)種群96份樣品基因組DNA進(jìn)行AFLP分析。結(jié)果表明：7對(duì)引物共獲得了330條清晰的條帶，其中276條為多態(tài)性條帶；每對(duì)引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)為29～59條；每對(duì)引物的多態(tài)性條帶百分率為70.73%～100.00%（圖1和表1）。

圖1 引物組合E-AGG/M-CTA部分材料擴(kuò)增圖Figure 1 Profile of some samples amplification by primer E-AGG/M-CTA

表1 7對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物組合及其擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Amplification resultsof different AFLP primer combinations

此外，除引物組合E-ACC/M-CAT外其他引物組合都擴(kuò)增出一定數(shù)量的特異性條帶（表2），福建長汀種群擴(kuò)增的特異性條帶數(shù)明顯多于江西全南種群。

表2 特異性條帶擴(kuò)增Table 2 Amplification of private bands

2.2 遺傳多樣性

多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL）、Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）、Nei，s基因多樣性（He）都是廣泛運(yùn)用的衡量物種遺傳多樣性的指標(biāo)。從表3可以看出，在物種水平，桂花的多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL）為83.64%，Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）為0.428 3，Nei，s基因多樣性（He）為0.285 6；在種群水平，江西全南種群和福建長汀種群的多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL）分別為48.48%和79.09%，平均為63.79%，Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）分別為0.263 1和0.414 8，平均為0.339 0，Nei，s基因多樣性（He）多態(tài)性指數(shù)分別為0.177 8和0.277 6，平均為0.2277。江西全南和福建長汀的觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)分別為1.4848和1.7909，1.309 0和1.471 4。

表3 桂花種群的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity index of Osmanthus fragrans in populations

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化

分子方差分析（AMOVA）（表4）表明：江西全南種群和福建長汀種群間的差異達(dá)極顯著（P＜0.001），種群內(nèi)的遺傳變異百分率為71%，種群間的變異百分率為29%，遺傳變異主要來源于種群內(nèi)部。這與Nei，s基因多樣性（Gst=0.161 6）的結(jié)果一致。根據(jù)遺傳分化系數(shù)，江西全南種群和福建長汀種群間的基因流（Nm）為2.594 9。

表4 96個(gè)桂花個(gè)體的分子方差分析（AMOVA）Table 4 Analysisofmolecular variation（AMOVA）for 96 individualsof Osmanthus fragrans

2.4 遺傳一致度和聚類分析

Nei，s遺傳一致度（0.888 2）和遺傳距離（0.118 5）結(jié)果表明江西全南種群和福建長汀種群間相似程度較高。2個(gè)種群不同個(gè)體間的UPGMA聚類分析表明，2個(gè)種群的不同個(gè)體均先聚為一類（圖2），表明地理隔離使得2個(gè)種群間有一定的遺傳分化。

圖2 江西全南（qn）和福建長汀（ct）桂花2個(gè)種群96個(gè)個(gè)體的UPGMA聚類圖Figure 2 UPGMA dendrogram of 96 individuals of Osmanthus fragrans from Quannan（qn）and Changting（ct）

3 討論

物種的遺傳多樣性水平與其繁育系統(tǒng)、種群結(jié)構(gòu)和地理分布格局等密切相關(guān)。從Nei，s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)來看，桂花的相關(guān)遺傳參數(shù)（He=0.285 6）均高于通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD），AFLP和簡單重復(fù)間序列（ISSR）等3種顯性標(biāo)記統(tǒng)計(jì)的多種植物的遺傳多樣性平均水平（He= 0.22或0.23）[10]，且高于25種廣布植物的平均水平（He=0.220 0）[10]，但低于珙桐Davidia involucrata（He= 0.333 6或0.342 9）[11-12]，南方紅豆杉Taxus chinensis var.mairei（He=0.419 2）[13]和光皮樺Betula luminifera（He=0.361 6）[14]，表明在種水平具有較高的遺傳多樣性。

植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)不僅取決于自身的遺傳基礎(chǔ)、交配系統(tǒng)等，還受到遺傳漂變、基因流和自然選擇等因素影響[15-17]。桂花遺傳變異主要存在于種群內(nèi)部，種群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.161 6，低于基于AFLP標(biāo)記的12個(gè)物種的平均水平（Gst=0.210 0）[10]，也低于9個(gè)廣布物種的平均水平（Gst=0.330 0）[10]，而高于光皮樺（Gst=0.065 0）[14]及南方紅豆杉（Gst=0.121 1）[13]。這表明桂花不同種群間遺傳分化不顯著，種群間存在一定的基因流，保證種群間遺傳信息的交換，從而維持物種水平較高的遺傳多樣性。

福建長汀種群的遺傳多樣性程度明顯高于江西全南種群，這與種群結(jié)構(gòu)等有著密切的關(guān)系。福建長汀種群（穩(wěn)定型）中存在世代更新現(xiàn)象，有利于種群內(nèi)不同世代間遺傳信息的傳遞以及遺傳變異的產(chǎn)生、維持甚至增加；而缺少世代更新能力的江西全南種群（衰退型）只能維持原有的遺傳多樣性水平，甚至由于人為破壞造成種群結(jié)構(gòu)和規(guī)模的變化，從而導(dǎo)致遺傳多樣性的下降。此外，不同的種群面積大小表現(xiàn)出不同的遺傳差異[18]，往往面積較小種群的遺傳多樣性程度比面積較大的種群低，而與樣本的數(shù)量沒有明顯的關(guān)系[19-22]。本研究結(jié)果同樣也支持這一觀點(diǎn)。

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Genetic structure of different natural Osmanthus fragrans populations based on AFLPmethod

XU Yichun1，HU Shaoqing2，ZHAO Hongbo3
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silvicuture，Zhejiang A&F University，Lin，an 311300，Zhejiang，China；2.College of Civil Engineering and Architecture，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China；3.School of Landscape Architecture，Zhejiang A&F University，311300 Lin，an，Zhejiang，China）

Osmanthus fragransis being concerned in recent years due to its high economic value and ornamental value.It can provide significant evidences for breeding of new cultivars and protecting of natural populationswith studying on the genetic diversity of natural populations ofO.fragrans.The genetic diversity of 96O. fragransindividuals of two natural populations from Quannan County of Jiangxi Province and Changting County of Fujian Province was estimated using amplified fragment length polymorphism（AFLP）method.A total number of 330 reproducible bands were amplified using seven AFLP primer combinations，and 276 bands were polymorphic with a proportion of 83.64%.At the species level，Shannon，s information index（I）was 0.428 3，the Nei，s genetic diversity（He）was 0.285 6，which indicated the genetic diversity of O.fragrans was rich；at the population level，Shannon，s information index and Nei，s genetic diversity of Fujian population was higher 1.5 than Jiangxipopulation，that showed Fujian population ownedmuch rich genetic resource.Moreover，AMOVA indicated themost total genetic variation waswithin populationswith a proportion of 71%and the lesswasamong the populations with a proportion of 29%.Meanwhile，a certain extent level of genetic differentiation（Gst=0.161 6）was detected among the populations and genetic flow was 2.594 9.[Ch，2 fig.4 tab.23 ref.]

botany；Osmanthus fragrans；AFLP；genetic diversity；genetic structure

Q948；S685.13

A

2095-0756（2014）02-0217-07

2013-09-01；

2013-10-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31101571）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y3100332）；浙江省農(nóng)業(yè)重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2012C12909-9）；浙江農(nóng)林大學(xué)青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2010RC01）

徐沂春，從事觀賞植物遺傳育種研究。E-mail：x1356784541@163.com。通信作者：趙宏波，副教授，博士，從事觀賞植物遺傳育種和植物繁殖生態(tài)等研究。E-mail：zhaohb@zafu.edu.cn