梁宗敏,杜 睿,杜鵬瑞,王亞玲,李梓銘 (中國科學院大學資源與環(huán)境學院,北京 100049)

北京大氣降水中細菌氣溶膠的多樣性研究

梁宗敏,杜 睿*,杜鵬瑞,王亞玲,李梓銘 (中國科學院大學資源與環(huán)境學院,北京 100049)

利用16S rRNA基因測序分類學技術(shù),分別以北京市區(qū)2011及2012年不同月份的降水樣品中細菌的基因組DNA為模板,通過克隆、測序構(gòu)建基因組文庫,研究了北京市大氣降水中細菌的群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性變化.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,變形菌門(Proteobacteria) (α-,β-,γ-)是北京市降水樣品中細菌的優(yōu)勢菌群(75.6%～100%),另外包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、異常球菌門(Deinococcus-Thermus)、藍藻門(Cyanobacteria)、硝化螺菌門(Nitrospira)、厚壁菌門(Firmicutes)共7個主要門類的細菌,以及未定菌(TM7).多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示,不同的降水樣品,細菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性均存在著差異性,冬季 12月份雪水樣品細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性明顯高于其他季節(jié)的樣品,細菌群落多樣性(Shannon, H)特點是,冬季>秋季>夏季.

降水；細菌；群落結(jié)構(gòu)；多樣性；16S rRNA

大氣水環(huán)境代表著一種極端的生存環(huán)境,低溫、低壓、高輻射、相對較低的pH值以及含有有機物與無機物相混合的復雜混合物[1].然而細菌不僅可以在這種環(huán)境下生存[2-3],而且還可以調(diào)節(jié)云與降水的理化性質(zhì)[4].大氣中的細菌通常吸附在塵埃粒子表面而懸浮在大氣中. 濕清除是大氣氣溶膠粒子的主要清除機制之一,它是指大氣氣溶膠粒子參與云滴的形成,并在云滴增長和發(fā)展為降水的過程中,被云、降水收集而隨降水下落至地面,包括云內(nèi)清除和云下清除兩個過程[5].降水過程能夠明顯沖刷和凈化大氣中的細菌等微生物氣溶膠[6-7].

大氣生物氣溶膠與城市空氣污染、城市環(huán)境質(zhì)量以及人類健康密切相關(guān)[8-9].城市生態(tài)系統(tǒng)中,大氣中微生物狀況是城市環(huán)境綜合因素的集中表現(xiàn),是評價城市空氣質(zhì)量的重要指標[10].近年來,國際大氣科學重新開始關(guān)注生物氣溶膠,尤其是細菌作為生物冰核在氣候變化、降水形成與分布過程中的作用及貢獻.已有的研究表明:細菌、真菌、病毒以及藻類等生物氣溶膠粒子可作為云凝結(jié)核(CCN)和冰核(IN),參與大氣云物理和化學過程,影響大氣降水、大氣化學以及微生物的地球化學循環(huán)[11-14].云中的異質(zhì)核化過程是影響大氣降水形成的關(guān)鍵因素之一,而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的冰核細菌(可以在-10℃以上較溫暖的溫度條件下催化液滴產(chǎn)生冰核的細菌[15])如Pseudomonas syringae,是被公認的冰核活性最強的菌種[16],研究發(fā)現(xiàn)它可在-2℃凍結(jié)[17].

為能更有效地反映大氣中的微生物群落結(jié)構(gòu),了解降水中微生物的群落變化機制,尤其是了解細菌的群落結(jié)構(gòu)與多樣性的變化特點非常必要.已有國內(nèi)外學者通過培養(yǎng)的方法獲得的大氣微生物氣溶膠中細菌的群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性

[18-19].然而,大氣中可培養(yǎng)細菌的量占總量的比值僅為 1%左右,對于細菌等微生物多樣性的認知,存在很大程度的不足[20].近些年,分子生物學技術(shù)在研究環(huán)境樣品微生物的多樣性及群落結(jié)構(gòu)中,已發(fā)展成為一種成熟且有效的方法[21-23].本研究是基于16S rRNA基因的分子生物學技術(shù)手段,通過多樣性分析與系統(tǒng)發(fā)育分析,對北京城市環(huán)境中2011年和2012年不同月份降水中細菌的群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性進行的了研究,旨在描述北京市降水中細菌的群落結(jié)構(gòu)、物種多樣性以及不同季節(jié)的變化特征.

1 材料與方法

1.1 采樣點

大氣降水樣品于2011年(8、12月)與2012年(5、6、7、8、9月)分別采集于北京市中國科學院大學教學樓二樓樓頂(39°54′N,116°14′E,高度約 10m)與北京市中國科學院大氣物理研究所實驗樓樓頂(39°55′N, 116°26′E,高度約 40m),兩者分別地處北京市西五環(huán)與北四環(huán),附近為科研樓以及居民生活區(qū).

1.2 樣品

1.2.1 樣品采集 2011年8月份采集的樣品(標記為B18)、12月(B112,雪),為保證每次實驗所需的雨水量,同時使用多個 3L玻璃燒杯收集雨水,杯口處加置可以增加接水面積的不銹鋼漏斗.每月多次收集雨水,每次收集時間不超過 24h,所接雨水盡快移至 4℃冰箱保存直至累積接雨量到1.5L左右開始過濾.

2012年5～9月的樣品(分別標記為B5, B6, B7, B8, B9)采集使用的是長沙湘藍科學儀器有限公司生產(chǎn)的降水自動采樣器(APS-2B).除在7、8月份的雨季是24h內(nèi)降水過程的雨水累積樣品,其他月份的雨水樣品通常是每月中多天次降水的累積樣品.以上實驗器材等用品使用前均經(jīng)過嚴格的高壓蒸汽滅菌處理.

1.2.2 樣品處理 使用真空抽濾泵(津騰公司)與硝化纖維素濾膜(孔徑 0.22μm,直徑 47mm,美國 Millipore公司生產(chǎn))進行雨水過濾,過濾雨水量為 1L.過濾之后的膜置于-20℃保存,雨水原液、濾液各取100mL于4℃保存.

1.3 樣品的處理

1.3.1 DNA的提取 在超凈臺中,把每個濾膜剪成碎片,分別裝入 2mL的離心管中,使用 FastDNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals公司,美國),按照操作說明提取DNA.提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳(TBE緩沖液)檢測,然后-20℃保藏.

1.3.2 PCR擴增 以上述提取的總 DNA作為擴增模板.采用細菌16S rRNA基因片段上的通用引物 27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')[24]對降水樣品進行PCR擴增.PCR儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)50μL的反應體系:200μM d NTP (Takara), 0.2μmol/L引物(Invitrogen),10×buffer (Takara), 2.5U Taq DNA聚合酶(Takar-a), 8% (W/V)BSA (美國).反應程序:95℃預變性5min;95℃變性1min;55℃退火1min;72℃延伸1.5min,35個循環(huán); 72℃延伸

10min.

1.3.3 克隆與測序 PCR產(chǎn)物使用 GeneJET PCR試劑盒(Fermentas,美國)按照操作說明進行純化,然后克隆;PCR純化產(chǎn)物與 pGEM-T Easy Vector (Promega,美國)在T4連接酶及緩沖液的作用下連接,4℃靜置 16h;連接體系按照操作說明轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH-5α(Takara)中,LB培養(yǎng)液中搖菌培養(yǎng)1.5h,然后把菌液涂布到含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上;篩選白色菌落采用M13f (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3')和 M13r(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')引物做菌落PCR,然后隨機挑選出 100個左右的陽性菌落,交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析 利用 Mallard軟件(http://www.bioinformatics-toolkit.org/Mall ard)對測序所獲得的16S rRNA序列片段進行嵌合體檢測,去除嵌合體.利用 Mothur軟件(http://www. mothur.org/wiki/OTU-based_approa-ches)按照不小于97%的相似性劃分成一個OTU(Operational Taxonomic Units)的原則,對樣品序列進行 OTU的劃分.利用RDP在線分類程序?qū)μ幚砗玫?6S rRNA序列片段進行初步的系統(tǒng)分類.把處理之后有效的16S rRNA序列片段提交到GeneBank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/),獲取序列號.最后,使用Mothur生成稀有度曲線以及群落系統(tǒng)發(fā)育樹. 1.4.2 物種多樣性指數(shù)分析 物種多樣性指數(shù)(Shannon’s diversity indices, H),物種豐度(Species richness, Chao 1),稀有度曲線(Rare-faction curves)與覆蓋率(Coverage)分別采用不同的Mothur程序(http://www.mothur.org/wiki/Shannon; http://www.mothur.org/wiki/Chao;http://www. mothur.org/wiki/Rarefaction.sin;http://www.mothur. org/wiki/Coverage)分析.

1.5 核酸序列提交號

將處理后的有效序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中,獲得的登錄號為KF010653-KF010774.

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rRNA序列多樣性指數(shù)分析

對472個克隆序列進行16S rRNA基因序列分析,分別來自 7 個不同樣品的克隆文庫:B5(69個克隆),B6(57 個克隆),B7(82 個克隆),B8(67 個克隆),B9(93個克隆),B18(59個克隆),B112(45個克隆).以序列相似性大于或者等于97%劃分為同一個 OTU 的標準進行多樣性分析,共有 113 個OTUs (表1).

表1 降水中細菌16S rRNA基因文庫生物多樣性指數(shù)與物種豐度評估Table 1 Biodiversity indices and richness estimators in the clone libraries based on 16S rRNA gene of the precipitation samplers

圖1 克隆文庫中基于OTUs的稀有度曲線Fig.1 Rarefaction curves of observed OTUs richness in the clone libraries

多樣性分析包括:稀有度曲線,群落系統(tǒng)發(fā)育樹,物種豐度,多樣性指數(shù)以及覆蓋率.從7個不同樣品劃分的OTUs與預期OTUs來看,樣品中細菌具有很高的多樣性.覆蓋率(80%～88%)表明樣品測序結(jié)果已包含了主要的細菌優(yōu)勢種群,這同基于物種豐度計算出來的稀有度曲線是一致的(圖 1).另外,不同月份降水中的細菌群落多樣性存在一定的差異.群落多樣性指數(shù)(H)以及物種豐度指數(shù)(Chao l)表明,2012年5～9月降水中的細菌群落多樣性有逐漸增加的趨勢;2011年8月份降水中細菌群落多樣性比同年 12月份的要低;2011年與2012年同期8月份降水中的物種多樣性存在一定的差異.

2.2 降水樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖2 細菌群落結(jié)構(gòu)比例組成Fig.2 Proportion of bacteria community structure

各樣品細菌群落結(jié)構(gòu)比例如圖2所示.變形菌門(革蘭氏陰性,G-)是優(yōu)勢菌群,在 B5,B6,B7, B8,B9,B18,B112中各占比例分別為87.0%,98.2%, 96.3%,97%,100%,98.3%,75.6%;不同時期樣品中變形菌綱(α-,β-,γ-)的比例各不相同,不同年份同時期的 B8(α-70.1%,β-25.4%,γ-1.5%)與 B18 (α-8.5%,β- 89.8%)細菌的比例組成也存在很大的差異.細菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,革蘭氏陰性菌(G-)明顯要多于革蘭氏陽性菌(G+),這與國內(nèi)外學者在不同環(huán)境中的研究結(jié)果一致,通過可培養(yǎng)的方法獲得細菌 G+均多于 G-[18-19],而通過非培養(yǎng)的方法所獲得的細菌則 G-多于 G+[25-27],這也符合 G-細菌可生活在低氣溫,甚至嗜冷環(huán)境中

[18]以及對輻射有抗性[28]的結(jié)論.

北京市大氣降水中的細菌具有很高的多樣性與豐富的群落結(jié)構(gòu)組成,本研究發(fā)現(xiàn)了 8個主要門類的細菌:變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、異常球菌門、藍藻門、硝化螺菌門、厚壁菌門以及未定菌門.變形菌門主要包括α變形菌綱,β變形菌綱,γ變形菌綱以及未分類的變形菌綱,其中β變形菌綱和γ變形菌綱屬于優(yōu)勢菌亞群,這與國內(nèi)外研究一致[25,29],以上研究表明,變形菌門類微生物適合在大氣水環(huán)境中生存.Fang等[19]和Gonzalez等[30]通過可培養(yǎng)的方法檢測北京市大氣中的細菌,所得到的只有變形菌門、厚壁菌門和放線菌門,說明可培養(yǎng)方法用于了解環(huán)境樣品細菌的多樣性,其靈敏度要低于分子生物學方法.另外,降水中存在一定量的未知菌(TM7,1.2%～7.2%),表明即使通過分子生物學方法,降水中仍有一部分細菌未被我們所認知.

目分類水平的細菌群落結(jié)構(gòu)組成見表 2,α變形菌綱中微生物主要有柄桿菌目(Caulobacterales),根瘤菌目(Rhizobiales),紅桿菌目(Rhodobacterales),螺 菌 目 (Rhodosperillales) 鞘 脂 單 胞 菌 目(Sphingomonadales),其中根瘤菌目(Rhizobiales)是α變形菌綱中的優(yōu)勢菌群.β變形菌綱中含有的微生物優(yōu)勢菌群是伯克氏菌目(Burkholderiales),同時,還有一定量未分類的微生物類群.γ變形菌綱中的微生物主要由潛在病原菌組成,除B18樣品外均發(fā)現(xiàn)了假單胞菌目(Pseudomonadales).根瘤菌目常生活在土壤環(huán)境中,土壤是大氣微生物氣溶膠的一個重要源,降水樣品中存在豐富的根瘤菌(例如 B8),可能是受到某一次人為或者自然活動的影響,同時也表明了大氣中微生物的群落結(jié)構(gòu)組成易受人為或自然活動的影響.假單胞菌目是寄生在植物上潛在的病原菌,大氣中普遍存在該類細菌,說明植被區(qū)域是大氣微生物來源的穩(wěn)健類型之一[5].

2.3 細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的季節(jié)性變化

聚類樹聚類在同一個分支上的樣品相似性較高,因此樣品 B5、B6、B7、B8、B9、B18、B112之間聚類分析結(jié)果(圖 3)表明:同一季節(jié)內(nèi)降水中微生物的群落結(jié)構(gòu)相似性較高,如夏季樣品B5、B6、B7;秋季樣品B8、B9;冬季樣品B112單獨聚類在一個分支,而且群落結(jié)構(gòu)相似性相比較秋天來看比夏天高;另外,2011年秋季樣品B18也是單獨聚類在一個分支,位置處在同年冬季樣品B112與次年秋季樣品B8、B9之間.這些現(xiàn)象表明降水中細菌的群落結(jié)構(gòu)與月份、季節(jié)以及年份相關(guān).這也驗證了把大氣降水樣品按照季節(jié)性劃分來分析細菌的群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性的可行性與正確性.同一季節(jié)內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較高,像夏季的B5、B6、B7;秋季的B8、B9.不同季節(jié)的細菌群落差異性顯著,像冬季(B12),秋季(B8,B9)與夏季(B5,B6,B7),它們的聚類結(jié)果完全在不同的分支結(jié)構(gòu)上.另外,相同月份不同年份的樣品分析結(jié)果也存在差異性,B8,B18多樣性指數(shù)與物種豐度指數(shù)均差別較大,而且聚類結(jié)果相似性較差,表明不同年份即使是相同時期的降水,其中的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性也會因氣象因素等條件變化而產(chǎn)生很大的差異,氣象條件能直接影響細菌的群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性[17].分子生物學分析結(jié)果表明,北京市各月份降水中的細菌存在差異性.總體而言,按照季節(jié)性劃分七個月份的樣品,細菌多樣性與物種豐度的趨勢為冬季(B112)>秋季(B8、B18、B9)>夏季(B5、B6、B7)(表2),這與2010年Fahlgren等[26]采集海邊空氣樣品得到的細菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致.但Fang等[19]與Kaarkainen等[31]通過直接采集培養(yǎng)大氣中的細菌的研究結(jié)果不一致,其多樣性與物種豐度則在夏秋季最高.造成結(jié)果不同的原因可能是,由于樣品的來源不同,后者收集的樣品直接取自于大氣樣品,而非來自于大氣降水;夏秋季雨水相對較多,濕沉降作用對大氣沖刷明顯,造成夏秋雨水中細菌的多樣性及物種豐度較冬季低;另外,已有研究表明大氣中的細菌能夠降解并利用大氣中的有機物,如甲酸、乙酸等[32],從我們同期觀測到的數(shù)據(jù)也顯示此類低分子量的有機酸濃度是冬季>夏秋季(數(shù)據(jù)略),大量的觀測結(jié)果顯示有機氣溶膠粒子是大氣云凝結(jié)核與冰核的重要組成成分[32],在提供給細菌附著點的同時也能夠滿足細菌代謝的營養(yǎng)需求,大氣中有機污染物可為細菌等微生物的生長與代謝提供所需的物質(zhì)

[33].夏季降水中發(fā)現(xiàn)了包括未定菌門在內(nèi)的 5個門類的細菌,秋季降水中發(fā)現(xiàn)了 3個門類的細菌,冬季降水中發(fā)現(xiàn)了5個門類的細菌,其中藍藻門、硝化螺菌門、厚壁菌門是冬季降水中獨有的.可能原因是冬季降水較少,大氣中懸浮的固體顆粒物懸浮時間較長,有助于微生物附著與生存.季節(jié)內(nèi)各月份細菌群落多樣性變化不大.Maron等

[34]研究認為,大氣中細菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化主要是由氣候以及大氣的改變所觸發(fā)的.

圖3 聚類分析不同降水中細菌群落的相似性Fig.3 Cluster analysis of the bacteria community from the different precipitation

表2 樣品中變形菌綱目分類的組成(%)Table 2 The taxonomic distribution of proteobacteria (Alpha-,Beta-,Gamma-) for each samples(%)

氣候在改變細菌群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性的同時,具有冰核活性的細菌對云與降水的形成也具有實質(zhì)性的影響,因此微生物至少可能在區(qū)域性地帶影響大氣水循環(huán)與氣候[13-14,35].本研究中經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn)樣品 B112含有假單胞菌屬,已經(jīng)證實具有很高冰核活性(Ice Nuclei Activity, INA)的丁香假單胞菌種[24,36]就是該屬菌種,一定程度上或許可以推測,大氣降水中可能存在著具有冰核活性的細菌而且能夠在云與降水過程中起到作用[37],這也是我們接下來的工作重點,利用分子生物學方法來揭示大氣降水中的冰核活性菌的存在與否.

3 結(jié)論

3.1 北京市大氣降水中的細菌群落具有很高的多樣性,共發(fā)現(xiàn)了8個門類的細菌,革蘭氏陰性菌比例大于革蘭氏陽性菌,其中優(yōu)勢菌群是變形菌門,β變形菌綱和γ變形菌綱屬于優(yōu)勢菌亞群.此外,大氣降水中還有一定量未被認知的細菌.

3.2 北京市大氣降水中的細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性,不同季節(jié)、不同年份均有所差異.整體而言,北京市大氣降水中的細菌多樣性具有季節(jié)性變化,冬季細菌多樣性最高,秋季次之,夏季最低.

3.3 北京市大氣降水中細菌群落的聚類分析結(jié)果表明,同一季節(jié)內(nèi)大氣降水的細菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高;季節(jié)性的氣候差異性越明顯,細菌群落間的相似性越低.

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致謝：感謝中國科學院大氣物理研究所在樣品采集階段提供的幫助與支持.

《中國環(huán)境科學》被Ei收錄

根據(jù)Ei 總部2013 年頒布的期刊收錄情況,《中國環(huán)境科學》已被Ei 數(shù)據(jù)庫作為源期刊收錄,詳見http://www.chinaeidata.com/periodical.htm

《中國環(huán)境科學》編輯部

2013-03-14

Phylogenetic diversity of bacteria areasols in precipitation of Beijing Area.

LIANG Zong-min, DU Rui*, DU Peng-rui,

WANG Ya-ling, LI Zi-ming (College of Resource and Environment, University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：317～323

Atmosphere bioaerosols was always closely linked with the health of human beings and flora and fauna, however, recent studies suggested that the bio-aerosols may impact the environment and climate change directly by acting as cloud condensation nuclei (CCN) and/or ice nucleation (IN). Unfortunately, there was still little knowledge about the composition of microbial community of the biological ice nucleis in the precipitation, especially, in China mainland. At present study, the precipitation samplers were taken from the Beijing city area. The sampling was carried out in different months in 2011 and 2012. The bacterial diversity was analyzed using the 16S rRNA gene sequencing based approaches. Seven clone libraries were established resulting from the different rain-water sampling months. The results indicated that Proteobacteria (75.6%～100%) were dominant in the precipitation including Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria,and Gammaproteobacteria. While other bacterial communities such as Bacteroidetes, Actinobacteria, Deinococcus-Thermus, Cyanobacteria, Nitrospira and Firmicutes were involved as well. Furthermore, a small proportion of undetermined bacteria (TM7, 1.2%～7.2%) were also found. In addition, microbial diversity in the snow water samplers was obviously much more than that in the rain-water samplers, which suggested that some biological ice nuclei may present and influence in the formation of precipitation. Moreover, results showed that Pseudomonas, in which some strains with high effective ice nucleation activity, was also found in the samplers. Therefore, further concerns should be done for the climatic effect of these microbes.

precipitation；bacteria；community；diversity；16S rRNA

X513

：A

：1000-6923(2014)02-0317-07

梁宗敏(1986-),男,河南周口鹿邑縣人,中國科學院大學碩士研究生,主要從事大氣生物氣溶膠的多樣性研究.

2013-06-21

國家自然科學基金(41175135)

* 責任作者, 副教授, ruidu@gucas.ac.cn