吳 君，韓 蕓，李寶紅

(1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264199；2.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺 264003；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808)

?

清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠抗炎作用探析

吳 君1，韓 蕓2，李寶紅3*

(1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺 264199；2.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺 264003；3.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808)

目的：考察清胃黃連丸對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠胸膜炎的影響。方法：采用大鼠胸腔注射0.2mL 1%角叉菜膠誘導(dǎo)胸膜炎模型，根據(jù)胸腔滲出液體積、滲出液中白細胞計數(shù)、PGE2含量、TNF-α含量評價清胃黃連丸抗急性炎癥的作用。結(jié)果：清胃黃連丸可顯著降低急性胸膜炎大鼠滲出液體積及滲出液中白細胞總數(shù)、PGE2含量、TNF-α含量。結(jié)論：清胃黃連丸對角叉菜膠所致急性胸膜炎大鼠有明顯的保護作用，作用機制可能與降低PGE2、TNF-α的含量有關(guān)。

清胃黃連丸；角叉菜膠；急性胸膜炎；PGE2； TNF-α

清胃黃連丸是中國藥典(2010版)收載的中成藥，由黃連、石膏、桔梗、甘草、知母、玄參、地黃、牡丹皮、天花粉、連翹、梔子、黃柏、黃芪和赤芍十四味中藥組成，具有清胃瀉火、解毒消腫之效，臨床上主要用于治療口舌生瘡、咽喉腫痛等[1]。前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)清胃黃連丸有較好的抗炎作用[2]，本文進一步研究清胃黃連丸對急性炎癥的作用，以期為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品及試劑

清胃黃連丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠)，阿司匹林(印尼拜耳公司，德國拜耳藥廠監(jiān)制)，角叉菜膠(Sigma公司)，腫瘤壞死因子-α試劑盒(上海卓康公司產(chǎn)品)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

恒溫水浴箱：成都泰盟醫(yī)療設(shè)備有限公司；電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠，T1000；RT-2100C酶標儀；XYJ-801型電動離心機：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；可調(diào)式移液槍；紫外可見分光光度計；OLYMPUS-IX51倒置顯微鏡。

1.3 動物

SPF級大鼠，雄性，60只，體重200～220g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2008-0020。

2 方法

2.1 動物分組、給藥與致炎[3]

取200～220g SPF級大鼠60只，按體重隨機分為6組，每組10只，即：正常組、模型組、阿司匹林組、清胃黃連丸低、中、高劑量組。按照表1中劑量連續(xù)灌胃給藥6d，給藥量均為10mL/kg。正常組和模型組給予等體積蒸餾水。于末次給藥后30min，乙醚輕度麻醉，除正常組外，各組大鼠均向右胸腔內(nèi)注射1%角叉菜膠0.2mL，正常組注入等量生理鹽水。致炎8h后將大鼠處死，用剪刀將右側(cè)胸壁肋軟骨處剪開一小口，可從該口到達胸腔。用微量移液器將胸腔內(nèi)全部滲出液吸出并計量，再用冰生理鹽水沖洗胸腔，沖洗液與滲出液合并，至離心管內(nèi)(冰浴)，3 000r/min離心10min，取上清液待測。

2.2 指標檢測

2.2.1 大鼠胸腔內(nèi)滲出液計量和白細胞計數(shù) 用移液槍將胸腔內(nèi)全部滲出液吸出并計量，吸取10μL原滲液用1%鹽酸水溶液作為稀釋液，在顯微鏡下用細胞計數(shù)板進行白細胞計數(shù)[4]。

2.2.2 胸腔滲出液中前列腺素E2(PGE2)含量測定 取胸腔滲液上清液150μL，加0.5mol·L-1KOH-甲醇溶液1mL，50℃水浴異構(gòu)化20min后，用甲醇稀釋至4mL，紫外分光光度計在波長278nm處測定其吸光度(OD)值，代表PGE2的生成量[5]。

2.2.3 胸腔滲出液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量測定 將待測樣品和配置好各濃度標準品100μL加入到預(yù)先已用抗大鼠TNF-α單克隆抗體包被的酶標板上：將反應(yīng)板充分混勻后置37℃溫箱90min，使標準品、待測樣品中的抗原與單抗充分結(jié)合；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次，在濾紙上印干；每孔(除空白孔外)中加入生物素化的一抗工作液100μL，置37℃溫箱60min；洗板；每孔(除空白孔外)加辣根過氧化物酶標記的親和素抗體工作液100μL，將反應(yīng)板置37℃溫箱60min，使酶標抗體工作液與生物素化一抗結(jié)合成復(fù)合物；洗板；每孔加入顯色劑100μL，置37℃暗處反應(yīng)10min；每孔加入100μL終止液混勻；在酶標儀上450nm處測各孔吸光值。將所有OD值減除空白值后，根據(jù)標準曲線，該曲線圖上查出每1mL組織勻漿中TNF-α的含量。

2.3 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液和白細胞計數(shù)的影響

與正常組相比，模型組大鼠胸腔注射角叉菜膠后出現(xiàn)明顯滲出液體積和白細胞總數(shù)顯著升高(P<0.01)，呈急性炎癥表現(xiàn)，說明大鼠胸膜炎造模成功。與模型組相比，阿司匹林組、清胃黃連丸各劑量組可顯著抑制胸膜炎大鼠炎性液的滲出及白細胞總數(shù)升高(P<0.01或P<0.05)。詳見表1。

表1 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔

注：與模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01。

3.2 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液中PGE2含量的影響

與正常組相比，急性胸膜炎大鼠滲出液中PGE2含量顯著升高(P<0.01)，阿司匹林組、清胃黃連丸各劑量組可顯著降低滲出液中炎癥介質(zhì)PGE2含量(P<0.01或P<0.05)。詳見表2。

表2 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔

滲出液中PGE2含量的影響

組別劑量(g·kg-1)PGE2含量(OD)正常組-0.247±0.0222)模型組-0.642±0.075清胃黃連丸1.50.423±0.0471)30.355±0.0232)60.292±0.0332)阿司匹林0.20.327±0.0312)

注：與模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01。

3.3 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠胸腔滲出液中TNF-α含量的影響

與正常組相比，急性胸膜炎大鼠滲出液中TNF-α含量顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，阿司匹林組、清胃黃連丸各劑量組可顯著降低滲出液中TNF-α含量(P<0.01或P<0.05)。詳見表3。

表3 清胃黃連丸對急性胸膜炎大鼠

胸腔滲出液中TNF-α含量的影響

組別劑量((g·kg-1)TNF-α含量(ng·mL-1)正常組-0.559±0.0762)模型組-1.352±0.196清胃黃連丸1.50.968±0.1511)30.881±0.1422)60.818±0.2322)阿司匹林0.20.938±0.1682)

注：與模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01。

4 討論

角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠胸膜炎模型是以炎性滲出和白細胞游走為主要改變的急性炎癥模型。炎性刺激可引起大量血漿蛋白質(zhì)(如酶類和炎性介質(zhì)等)的分泌，導(dǎo)致炎性滲出液中蛋白含量大大增加。故大鼠胸膜炎炎性滲出液量、滲液中的白細胞游走數(shù)可作為衡量炎癥的重要指標。

PGE2由環(huán)氧合酶(COX)催化花生四烯酸合成，COX存在兩種異構(gòu)體，即COX-1及COX-2。COX-l是結(jié)構(gòu)酶，在正常生理情況下具有活性，催化生成的PGE2具有多種重要生理功能；COX-2是誘導(dǎo)酶，生理狀況下活性很低，當(dāng)受到某些因子刺激后，在炎癥細胞中高表達，水平急劇增加，進而引起炎癥部位PGE2等產(chǎn)物大量增加,促進炎癥反應(yīng)及組織損傷[6]。本實驗中清胃黃連丸可減少大鼠胸膜炎滲出液中PGE2含量，提示其抗炎作用可能與其抑制COX-2的活性，進而阻斷炎性介質(zhì)PGs的合成與釋放有關(guān)。

TNF-α是一種由活化的單核-巨噬細胞分泌的促炎癥因子，是導(dǎo)致炎性介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子。其可通過多種生物學(xué)途徑誘發(fā)或激活體內(nèi)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，它們又相互作用，相互影響，加重組織的損傷和炎癥[7]。本實驗中清胃黃連丸可顯著抑制炎癥時細胞因子TNF-α的大量產(chǎn)生，從而達到抗炎的效果。細胞因子之間的作用是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還有許多細胞因子在炎癥中發(fā)揮重要的作用。如IL-2、IL-8、IL-10、IL-19等都在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮或拮抗或促進作用。清胃黃連丸對這些因子是否有影響，還有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:444.

[2] 李寶紅,吳君,鄧妙麗,等.清胃黃連丸抗炎作用的實驗研究[J].西北藥學(xué)雜志,2011,26(3):192-193.

[3] 徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:714.

[4] 李東曉,陳東輝,羅霞,等.鹿角菜膠所致小鼠胸膜炎模型[J].中藥藥理與臨床,2000,16(5):46-47.

[5] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:370-371.

[6] 唐秀能,黃建春,賀敏,等.月光花豆乙醇提取物對大鼠急性胸膜炎的作用及其機制的研究[J].北京中醫(yī)藥,2009,28(8):641-643.

[7] 吳洪福，耿排力.炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)與疾病[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,24(4):267.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Anti-inflammatory Effects of Qingwei Huanglian Pill on Rats With Acute Pleurisy

Wu Jun1, Han yun2，Li Baohong3*

(1.Shan Dong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai 264199,China；2.Binzhoiu Medical University Yantai 264003,China; 3. Pharmaceutical School of Guangdong Medical College，Dongguan 523808,China)

Objective:Studying effects of Qing wei Huanglian Pill on rats pleurisy induced by carrageenan. Methods:Pleurisy model was induced by injection of carrageenan 0.2mL1% into rat pleural.The anti-acute inflammation effects of Qingwei Huanglian Pill was evaluated by detection of pleural effusion volume，exudate leukocyte count，the contents of TNF-α and PGE2.Results:Qingwei Huanglian Pill significantly reduces the pleural effusion volume of rats with acute pleurisy，the white blood cell count of exudates and the contents of TNF-α and PGE2.Conclusion:Qingwei Huanglian Pill have a significant protective effect on rats with acute pleurisy induced by carrageenan.Mechanism of action may be related to lower levels of PGE2, TNF-α.

Qingwei Huanglian Pill；Carrageenateacute Pleurisy；PGE2；TNF-α

2014-05-04

吳君(1981-)，男，山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校講師，研究方向為中藥復(fù)方藥理學(xué)。

李寶紅(1968-)，男，廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院副研究員，研究方向為藥物載體與控制釋放。

R561.1

A

1673-2197(2014)17-0008-02