周啟仲

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510120)

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HPLC在中藥有效成分分析中的應(yīng)用

周啟仲

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510120)

目的：分析HPLC在中藥及其制劑有效成分分析中的應(yīng)用。方法：應(yīng)用HPLC分析法，對(duì)中藥及其制劑中有效成分的含量進(jìn)行分析，研究HPLC法的應(yīng)用效果。結(jié)果：白花蛇舌草中齊墩果酸含量測(cè)定的平均回收率為97.04%，RSD為2.09%；而熊果酸含量測(cè)定的平均回收率為96.79%，RSD為2.66%。采用醇提取法與酸解法分別提取中藥，經(jīng)HPLC分析，兩種提取法提取的中藥及其制劑的有效成分含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：HPLC法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分離效果好等特點(diǎn)，是測(cè)定中藥有效成分的有效方法。

HPLC；中藥；有效成分分析

HPLC即高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography ，HPLC)，是以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等泵入裝有固定相的色譜柱中，各成分在柱內(nèi)被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器中進(jìn)行檢測(cè)的分析方法。近年來(lái)，隨著HPLC的不斷完善，其在工業(yè)、農(nóng)學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用也越來(lái)越普遍[1]。本文具體分析了HPLC在中藥有效成分分析中的應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

儀器：高效液相色譜分析儀LC-3000(艾倫分析儀器有限公司)，色譜數(shù)據(jù)工作站V4.0+，磁力加熱攪拌器(國(guó)華企業(yè)，79-1型)。

中藥：中藥材有枇杷葉、毛冬青、澤蘭、女貞子、紫蘇、茵陳、白花蛇舌草等；對(duì)照品有齊墩果酸、熊果酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

色譜條件：色譜柱：CLC-ODSC18(150mm×6.0mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇∶水∶冰乙酸∶三乙胺(87∶13∶0.04∶0.02)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210mm。在上述色譜條件下，齊墩果酸與熊果酸的拖尾因子均小于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000。

(1)酸解法。精密稱(chēng)取山楂、枇杷葉、毛冬青、澤蘭、女貞子、紫蘇、茵陳、白花蛇舌草、連翹、三七等藥材粉末各1.0g，并將其分別置于100mL燒瓶?jī)?nèi)，于燒瓶中加入適量鹽酸及乙醇，回流提取2h。將燒瓶?jī)?nèi)溶液定量轉(zhuǎn)移到容量瓶中，滴加飽和NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.0，再采用乙醇定容、過(guò)濾，取續(xù)濾液1mL離心，取上清液進(jìn)樣分析。

(2)醇提法。精密稱(chēng)取山楂、枇杷葉、毛冬青、澤蘭、女貞子、紫蘇、茵陳、白花蛇舌草、連翹、三七等藥材粉末各1.0g，并將其分別置于100mL燒瓶中，加入50mL無(wú)水乙醇，采用水浴法加熱回流2h，提取液冷卻后過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定分析。

(3)對(duì)照品溶液制備。本研究選擇的對(duì)照品為齊墩果酸與熊果酸，精密稱(chēng)取齊墩果酸10mg和熊果酸15mg，分別置于50mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解稀釋至刻度。

1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)包括精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、線性試驗(yàn)與穩(wěn)定性試驗(yàn)。

(1)精密度試驗(yàn)。精密稱(chēng)取6等份白花蛇舌草粉末，按醇提法提取后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果：白花蛇舌草樣品中齊墩果酸峰面積RSD為1.46%，熊果酸峰面積RSD為1.89%，表明該法精密度良好。

(2)線性試驗(yàn)。分別精密吸取齊墩果酸和熊果酸對(duì)照溶液各0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0mL，置于50mL容量瓶中，采用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度為橫軸對(duì)峰面積積分進(jìn)行線性回歸。線性回歸方程如下所示[2]：

A=1.513 677 7C+3.737 683 4(r=0.999 5)

A=2.353 940 09C-7.404 378 2(r=0.999 2)

(3)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱(chēng)取白花蛇舌草粉末適量，按照醇提法制備樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積積分，結(jié)果表明齊墩果酸含量RSD為2.68%，熊果酸含量RSD為2.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。采用醇提法制備白花蛇舌草樣品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、16、18、24h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明齊墩果酸峰面積RSD為1.086%，熊果酸峰面積RSD為1.78%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果

2.1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

精密稱(chēng)取已測(cè)得有效成分含量的白花蛇舌草6份，分別加入一定量的齊墩果酸與熊果酸，采用醇提法提取后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算有效成分含量和加樣回收率。結(jié)果表明，齊墩果酸的平均回收率為97.04%，RSD為2.09%，而熊果酸的平均回收率為96.79%，RSD為2.66%，均符合要求，如表1所示。

表1 回收率檢測(cè)結(jié)果分析

2.2 兩種提取法樣品測(cè)定結(jié)果比較

分別采用醇提法與酸解提取法對(duì)本研究所選中藥進(jìn)行提取，并采用HPLC法測(cè)定有效成分含量，結(jié)果表明，兩種方法提取所得的齊墩果酸和熊果酸含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，如表2所示。

表1 兩種提取法對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果比較 (mg/mL)

3 討論

“色譜法”和“色譜圖”這一概念首次由俄國(guó)植物化學(xué)家茨維特于1903年提出，其于研究文章中寫(xiě)道：“一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱(chēng)之為色譜圖”。之后，隨著時(shí)代的不斷演變和科技的快速發(fā)展，相繼又出現(xiàn)了薄層色譜、紙色譜、離子交換色譜等技術(shù)。直至到1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國(guó)內(nèi)外迅速發(fā)展，高效液相色譜技術(shù)更廣泛地應(yīng)用于分離、純化、制備課題中，應(yīng)用前景愈加廣闊[3]。

近年來(lái)，隨著分離技術(shù)的發(fā)展，HPLC在中藥及其制劑有效成分分析中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。由于中藥及其制劑化學(xué)成分非常復(fù)雜，為保證臨床應(yīng)用中藥的合理性與安全性，很有必要對(duì)中藥及制劑的有效成分、作用機(jī)理、特點(diǎn)、藥物反應(yīng)等進(jìn)行全面、綜合、科學(xué)的分析。HPLC法具有操作方便、適用范圍廣、分離速度快、重現(xiàn)性好、靈敏度高、柱效高等特點(diǎn)，對(duì)衡量中藥及其制劑的質(zhì)量是否達(dá)到要求，產(chǎn)品是否穩(wěn)定具有十分重要的作用[4-5]。

本研究分別采用酸解提取法與醇提法提取枇杷葉、毛冬青、澤蘭、女貞子、紫蘇、茵陳、白花蛇舌草等中藥材中的有效成分齊墩果酸和熊果酸，結(jié)果表明，兩種提取方法所得的有效成分含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，HPLC法具有高靈敏度、高選擇性、高效性等優(yōu)點(diǎn)，在測(cè)定中藥及其制劑有效成分含量方面優(yōu)勢(shì)明顯，是最常用的含量測(cè)定方法。雖然其仍存在色譜柱易污染、柱容量小等缺點(diǎn)，相信隨著分離技術(shù)的發(fā)展，HPLC技術(shù)將會(huì)更加完善、高效、靈敏。

[1] 朱桃花,范璐,錢(qián)向明,等.HPLC分析植物油脂甘油三酯結(jié)構(gòu)組成的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)油脂,2011,36(5):59-63.

[2] 湯君,何彩玉,程杰,等.恩曲他濱對(duì)映異構(gòu)體的合成、表征及HPLC分析[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2014,2(2):294-297.

[3] 李南薇,鐘銀鏈.木瓜葉氨基酸提取工藝優(yōu)化及組成成分的HPLC分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,11(11):119-121.

[4] 李岑,肖遠(yuǎn)燦,楊紅霞,等.HPLC分析不同來(lái)源藏藥當(dāng)佐中4種指標(biāo)成分的含量[J].中國(guó)中藥雜志,2011,8(8):162-164.

[5] 顏軍,侯賢燈,徐開(kāi)來(lái).柱前衍生HPLC分析銀耳多糖的單糖組成[J].中國(guó)測(cè)試,2011,37(1):44-47.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2014-06-04

周啟仲(1968-)，男，廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幉蔫b定和保管。

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1673-2197(2014)18-0025-02