郭明麗，胡志雄，齊玉堂，張維農(nóng)

(武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢430023)

食品中的氯丙醇污染已成為國際關注的食品安全問題，其中 3-氯-1，2-丙二醇(3-MCPD)是氯丙醇類食品污染物中最常見的代表物質(zhì)，主要毒害神經(jīng)系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)，容易誘發(fā)神經(jīng)病和心臟病，動物實驗顯示3-MCPD可產(chǎn)生致癌作用，并具有遺傳毒性［1］。食品添加劑和污染物聯(lián)合專家委員會(JECFA)以及歐盟食品科學委員會(SCF)等暫定了人體每日最大耐受量(TDI)為 2 μg/(kgbw·d)［1］。

3-MCPD最早由原捷克斯洛伐克科學家Velisek首先在酸水解植物蛋白(HVP)中發(fā)現(xiàn)［2］。其后又陸續(xù)在麥芽提取物、變性淀粉、肉類提取物、餅干、面包、香腸、谷物類等中檢出，最近又在食用油中也檢測到3-MCPD的殘留污染。環(huán)境水體中，由于工業(yè)廢水的排放也會導致一定程度的3-MCPD污染，如酸水解植物蛋白生產(chǎn)廢水的排放、紙漿生產(chǎn)過程中濕強劑——聚酰胺聚胺表氯醇樹脂的使用都是產(chǎn)生3-MCPD污染的重要來源，如不經(jīng)處理會導致附近水體的污染［3］;另外，在水處理過程中多胺絮凝劑的使用也會產(chǎn)生一定程度的3-MCPD污染［4］。由于3-MCPD對人體危害嚴重，許多國家都制定了限量標準來控制食品及飲用水中的該項污染物，如英國飲用水檢查機構(gòu)(Drinking Water Inspectorate，DWI)規(guī)定飲用水中3-MCPD的最大含量不得超過0.1 mg/L。

由于食品及飲用水中3-MCPD安全限均達到10－9級，故必須采用靈敏度高的檢測方法才能達到監(jiān)控要求，目前常用的手段主要為氣相色譜(GC)、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC—MS)。由于3-MCPD的極性與沸點較高，測定過程中均需要將3-MCPD從水樣中富集、萃取出來，然后進行衍生化測定。如Matthew等［5］對水樣中的3-MCPD進行萃取、吹干、HFBA衍生化處理，然后采用 GC-ECD測定;González 等［6］采用固相萃取(SPE)對水樣中 3-MCPD進行富集濃縮，然后使用BSTFA進行衍生化，采用 GC-MS進行分析，檢測限可達1.4—11.2 ng/mL。

然而，由于3-MCPD水溶性好，沸點較高，故基于氣相色譜測定水樣中3-MCPD的分析方法具有以下幾方面的缺點:(1)需要采取繁瑣、復雜的萃取、濃縮過程，將3-MCPD從水相中提取出來，該前處理過程工作量大，且易產(chǎn)生操作誤差;(2)3-MCPD必須進行衍生化處理，且衍生化條件苛刻，需要對樣品進行無水化處理，否則誤差較大;(3)GC-MS測試儀器昂貴、維護使用成本高，并且對使用者業(yè)務能力有較高要求。故發(fā)展新型分析方法對檢測環(huán)境水樣中的3-MCPD具有十分重要的意義。

本文建立了一種高效液相色譜—熒光法(HPLC－FLD)對環(huán)境水樣中的3-MCPD進行測定方法，該方法不需要采取繁瑣、復雜的萃取、濃縮過程將3-MCPD從環(huán)境水樣中提取出來，而是簡單對水樣進行氧化裂解預處理、熒光衍生化，全部過程均在水相中進行，處理好的樣品直接進行高效液相色譜—熒光法測定，因而具有操作簡便、測試成本低廉、檢測準確度和靈敏度高、儀器設備要求低等諸多優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 主要儀器及試劑

3-MCPD 標準品(97%)、腺嘌呤(99.0%)、氯乙醛二乙縮醛(99.0%)、甘油(99.5%)購自美國 Sigma公司;高碘酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸均為分析純，購自阿拉丁試劑(上海晶純實業(yè)有限公司);色譜級甲醇購自美國Tedia公司;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

HHS電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)，PHS-3C雷磁pH計(上海精科電子有限公司)，XW-80A微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)，Cary Eclipse型熒光分光光度計 (美國瓦里安儀器有限公司)，Waters高效液相色譜儀:Waters1525二元泵，Waters 2475多波長熒光檢測器，Waters 2707自動進樣器，Breeze-2色譜工作站;色譜柱為 Phenomenex ODS柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。

1.3 實驗方法

1.3.1 3-MCPD 樣品的處理

3-MCPD標品的處理:稱取10 mg 3-MCPD標準品用二次水溶解定容于100 mL容量瓶中，配成濃度為100μg/mL的母液，取25μL的母液用二次蒸餾水定容于25 mL容量瓶中，稀釋成100 ng/mL的標準溶液備用。

樣品預處理:在具塞試管中加入2 mL 3-MCPD(100 ng/mL)的標準溶液，然后加入0.1 mL NaIO4溶液(250 mM)，用漩渦混合儀混合均勻，在室溫暗處反應30 min，反應完后加入0.1 mL Na2SO3溶液(275 mM)，混勻后在室溫下反應20 min。

樣品熒光衍生化:根據(jù)Huang等報道［7］的氯乙醛衍生化過程略作修改，在上述樣品溶液中加入0.2 mL的腺嘌呤(16 mg/mL)溶液(用0.1 M PBS溶液配制，pH 4.5)，旋渦混合均勻，在90℃水浴條件下反應3 h，反應結(jié)束后冷卻至室溫。在進高效液相色譜檢測前樣品儲存在4℃條件下。作為對照，氯乙醛按相同方法進行處理。

1.3.2 樣品的高效液相色譜(HPLC)檢測

色譜條件:流動相為甲醇—水(20∶80，V/V)，檢測的激發(fā)波長(λEx)為308 nm，發(fā)射波長(λEm)為405 nm，流動相流速為 0.6 mL/min，進樣體積為20μL。上述樣品在HPLC檢測前用0.22μm有機相濾膜過濾。

1.3.3 樣品的熒光檢測

美國Varian公司配有閃爍氙燈和10 mm石英比色皿的Cary Eclipse型熒光分光光度計，激發(fā)波長和發(fā)射波長狹縫均設定為5 nm，數(shù)據(jù)掃描速率為600 nm·min-1，用熒光分光光度計進行相關光譜條件優(yōu)化。衍生化后樣品經(jīng)HPLC分離后采用熒光檢測器進行定性測定。

1.3.4 精密度實驗和加標回收率實驗

(1)精密度實驗:配制 0.04 μg/mL，0.1 μg/mL，0.2μg/mL的三種不同濃度的3-MCPD標準溶液，每種分別采用在同一天測定5次和連續(xù)5 d測定的方式進行檢測，根據(jù)測得的εAde的峰面積得出實際濃度，然后來評價實驗的精密度。

(2)加標回收率實驗:用超純水配制0.25μg/mL，1.12μg/mL的兩種不同濃度的3-MCPD樣品，每種取2mL，分別加入50mL，100mL，200mL的10 μg/mL的3-MCPD標準溶液，按照優(yōu)化后的方法進行檢測，得到εAde的實際峰面積，然后根據(jù)標準曲線計算的理論值得出回收率。

1.3.5 樣品的檢測

收集自來水(2012-07-12，武漢輕工大學1號實驗樓820實驗室)、長江水(2012-06-20，武漢二橋橋底)、武漢東湖水(2012-06-20，武漢大學凌波門對面)、武漢紙廠附近(2012-06-20，武漢造紙廠外小河流下游)水域的水樣，經(jīng)離心、濾膜處理后按以上HPLC-FLD方法進行檢測，根據(jù)目標峰的峰面積和標準曲線計算其3-MCPD的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-FLD法測定3-MCPD的原理

眾所周知，鄰二醇結(jié)構(gòu)化合物可以被高碘酸鹽氧化裂解，生成相應的醛類化合物，該反應自1928年Malaprade首次發(fā)現(xiàn)以來［8］，已經(jīng)被廣泛應用于環(huán)境、地質(zhì)和生物等多種樣品的檢測，最近Vlessidis［9］將其應用于多糖和低聚糖的結(jié)構(gòu)檢測和表征中。3-MCPD是一種典型鄰二醇結(jié)構(gòu)化合物，經(jīng)高碘酸鈉氧化分解后生成小分子的氯乙醛和甲醛，其中氯乙醛為其特征降解產(chǎn)物，腺嘌呤(Ade)可以與其選擇性衍生化，生成強熒光性物質(zhì)εAde，通過測定目標峰εAde可以對樣品中3-MCPD的含量進行定量測定;圖1顯示了該方法測定3-MCPD的機理。

2.2 Ade和衍生化產(chǎn)物εAde的熒光光譜分析

圖1 氧化、熒光衍生化測定3-MCPD的原理

為了使建立的HPLC-FLD方法獲得高靈敏度和低檢測限，確定最佳熒光測定波長，本實驗對衍生化產(chǎn)物εAde的熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜進行了比較測定，圖2為兩者的熒光光譜比較結(jié)果。從圖2可以看出，εAde的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為311 nm和405 nm，與Ade(激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為291 nm和380 nm)相比，其最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別紅移了15 nm和25 nm，為了獲得較好的檢測靈敏度與選擇性，檢測時均將εAde的激發(fā)波長和發(fā)射波長設為測定波長，即λEx=311 nm，λEm=405 nm。

圖2 Ade和衍生化產(chǎn)物εAde的激發(fā)光譜(虛線)與熒光發(fā)射光譜(實線)比較

2.3 處理后樣品的HPLC色譜分析

腺嘌呤及衍生化產(chǎn)物 εAde的疏水保留均較弱，為了盡量延長保留時間以減少干擾物質(zhì)對其分析準確度的影響，本實驗采用了較長的色譜柱(25 cm)與有機相含量較低的流動相對其進行色譜測定，實驗中還對空白PBS緩沖液、衍生化試劑Ade和3-MCPD、氯乙醛的色譜分析結(jié)果進行對比，以確定最終熒光衍生化產(chǎn)物的色譜峰位置，比較結(jié)果如圖3所示。譜圖顯示:3-MCPD和氯乙醛樣品中均出現(xiàn)產(chǎn)物εAde的色譜峰，并且與衍生化試劑Ade的色譜峰能夠很好地分離，其保留時間分別為13.1 min和6.9 min，良好的分離效果與對稱峰形確保該方法具有良好的準確度;熒光檢測器的使用也使得該方法具有良好的選擇性與優(yōu)異的檢測靈敏度。

2.4 3-MCPD的定量分析結(jié)果評價

為了考察該方法的線性，本實驗在優(yōu)化條件下，調(diào)節(jié)3-MCPD的濃度從1—1 000 ng/mL，以峰面積作為考察對象，繪制標準曲線，得到相應回歸方程為Y=(1.908X+2.702)×104，線性相關系數(shù) R2=0.9996。該方法靈敏度非常高，根據(jù)基線噪音峰的三倍來計算該方法的最低檢測限為0.36ng/mL，這與Carro報道［10］的 GC-MS/MS方法相近，比 Matthew報道［5］的GC-ECD方法更低。另外通過對10 μg/mL3-MCPD標準品和9.0μg/mL的氯乙醛標準溶液的峰面積比較，得出3-MCPD轉(zhuǎn)化為氯乙醛的得率為98.96%，這說明高碘酸氧化對該方法的影響是可以忽略的。

圖3 衍生化產(chǎn)物及對照樣品色譜分析圖

為了考察方法的精密度，實驗以三種不同濃度的3-MCPD樣品作為模擬樣品，對每種樣品進行同一天測量5次和連續(xù)測量5d兩種不同的重復性實驗，實驗結(jié)果如表1所示:同一天重復測量的重現(xiàn)性范圍為97.04%—101.89%，精密度范圍為2.2%—4.8%;連續(xù)5d測量的重現(xiàn)性范圍為97.48%—100.28%，精密度范圍為 3.6%—5.1%，這說明該方法具有良好的重現(xiàn)性和精密度。

表1 精密度實驗結(jié)果

模擬兩種不同濃度的樣品，加入不同量的標品，通過實際得到的峰面積與理論值比較，得到該方法的回收率，實驗結(jié)果見表2。從表2中可以看出所有樣品的回收率在93%以上，平均回收率在95.72%，相對標準偏差在2.63%—3.49%之間，說明該方法的精確度很高。

表2 加標回收率實驗結(jié)果

2.5 實際環(huán)境水樣的分析

為了考察本方法對實際環(huán)境水樣的分析效果，采集了自來水、江水、湖水、造紙廠附近水域(零下18℃冷凍保存)的水樣600mL，按實驗方法的步驟進行處理、分析，測試的結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，雖然實際水樣成分比較復雜，但使用該方法測定時，譜圖中干擾峰較少，對測定基本上沒產(chǎn)生影響，說明該方法的選擇性很好，非常適合環(huán)境水樣中3-MCPD的測定。從水體中測得3-MCPD平行三次結(jié)果如表3所示，可以看出檢測結(jié)果的精密度范圍在1.19%—5.83%，可知通過該方法檢測的3-MCPD重現(xiàn)性非常好。比較四種水樣目標峰的大小可知，自來水樣中3-MCPD最低，而紙廠附近水域的3-MCPD含量較高，根據(jù)相應的εAde峰面積進行計算，自來水、江水、湖水、紙廠水樣中3-MCPD含量分別為2.3 μg/L，6.5 μg/L，9.2μg/L，11.2 μg/L，均明顯低于DWI飲用水的標準。

表3 不同水體中3-MCPD的含量

圖4 幾種不同環(huán)境水樣色譜分析圖

3 結(jié)論

筆者建立了一種HPLD對環(huán)境水樣中的3-MCPD進行測定方法，該方法不僅操作簡便、測試成本低廉，而且靈敏度高、準確度好，對儀器設備要求也較低，優(yōu)化條件下的標準曲線線性良好，其最低檢測限為0.36 ng/mL，達到甚至優(yōu)于文獻報道的GCMS/MS的檢測方法;日內(nèi)與日間重現(xiàn)性評價結(jié)果表明該方法具有良好的穩(wěn)定性、準確度和精密度。對四種不同來源的實際環(huán)境水樣測試結(jié)果表明，該方法選擇性好，譜圖中干擾峰少，目標峰形對稱，非常適合環(huán)境水樣的測定。

［1］Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives.Summary of the Fifty-seventh Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives［C］.Rome，2001，5-14.

［2］Velisek J.Zeitschrift für Lebensmitte I-Untersuchung and Forschung［J］.1978.European Food Research and Technology，167:241-245.

［3］Alistair I，Ian C.Review of the Industry Guideline for the Compliance of Paper＆Board Materials and Articles for Food Contact［J］.England:CEPI，2010:25.

［4］Richard B，Jo P，Nash V.Exposure to Chloropropanols via Polyamines［R］.LGC Limited，2003.

［5］Matthew BM，Anastasio C.Determination of halogenated mono-alcohols and diols in water by gas chromatography with electron-capture detection［J］.JChromatogr A，2000，866:65-77.

［6］Paula G，Inés R.Combined solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry used for determination of chloropropanols in water［J］.JSep Sci，2011(34):2697-2704.

［7］Huang ZQ，Waxman D J.High-performance liquid chromatographic-fluorescentmethod to determine chloroacetaldehyde，a neurotoxicmetabolite of the anticancer drug ifosfamide in plasma and in liver microsomal incubations［J］.Anal Biochem，1999(273):117-125.

［8］Malaprade M L.Action of polyalcohols on periodic acid.Analytical application［J］.Bull Soc Chim France，1928(43):683-696.

［9］Vlessidis A G，Evmiridis N P.Periodate oxidation and its contribution to instrumentalmethods of micro-analysis-A review［R］.Anal Chim Acta，2009，652:85-127.

［10］Racamonde I，Gonzalez P，Lorenzo R A，et al.Determination of chloropropanols in foods by one-step extraction and derivatization using pressurized liquid extraction and gas chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2011(1218):6878-6883.