周慧林，梅雪臣，繆禮鴻

(武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023)

棉籽粕中的粗蛋白含量達40%左右，是一種重要的蛋白質(zhì)飼料資源。但由于棉籽餅粕中存在有毒物質(zhì)棉酚等原因限制了其在養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用。有研究表明，酵母菌、霉菌和細菌等多種微生物對棉酚均具有一定的降解作用［1-4］。通過微生物發(fā)酵作用不僅可使棉粕中的游離棉酚含量大大降低，而且能顯著提高棉粕的營養(yǎng)物質(zhì)含量及消化吸收率［5-7］。本文對釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母三種酵母棉酚的培養(yǎng)基上的生長能力進行了比較，報道了一株具有較好的棉酚降解能力的產(chǎn)朊假絲酵母菌株的培養(yǎng)特征及用于固態(tài)發(fā)酵飼料的試驗效果。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

供試菌株:產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)1087等6株酵母菌為實驗室保存的菌株。以醋酸棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基:硫酸銨5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，氯化鈉 0.1g/L，硫酸鎂 0.5g/L，氯化鈣 0.1g/L，酵母膏0.2g/L，醋酸棉酚0.25g/L。固體培養(yǎng)基的瓊脂含量為2%。固體發(fā)酵培養(yǎng)基:紅薯渣100g，棉籽粕 80g，酒精糟 70g，含水率 50%，pH 4.5。

1.2 不同酵母菌在含醋酸棉酚的固體培養(yǎng)基上的生長情況

將經(jīng)過活化的酵母菌轉(zhuǎn)接到以醋酸棉酚為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)2 d后觀察其生長情況。

1.3 產(chǎn)朊假絲酵母生長曲線的測定

從以醋酸棉酚為唯一碳源的平板上挑取一環(huán)產(chǎn)朊假絲酵母1087菌種，接種到裝有10mL YPD發(fā)酵液的容積為25 mL的安瓿瓶中，于37℃、170 r/min搖床培養(yǎng)1 d。按5%的接種量接種于以醋酸棉酚為唯一碳源的100 mL液體培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2h取樣，用血球計數(shù)板法測總菌數(shù)并在600 nm下測OD值［8］。

1.4 固態(tài)發(fā)酵條件

將產(chǎn)朊假絲酵母1087種子液按一定比例接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，使接入培養(yǎng)基中的起始酵母菌數(shù)達到0.1億個/g。30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h。發(fā)酵完畢后于80℃烘干，保存樣品用于飼料分析。

1.5 游離棉酚測定

采用國標GB 13086-91“飼料中游離棉酚的測定方法”［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酵母菌對醋酸棉酚的利用結(jié)果

選取產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母和釀酒酵母菌各2株，分別接種至醋酸棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，從圖1中可以看出，產(chǎn)朊假絲酵母1087在平板上生長最好，而熱帶假絲酵母和釀酒酵母在平板上均生長很弱。

2.2 產(chǎn)朊假絲酵母1087生長曲線的測定

圖1 不同酵母菌在以醋酸棉酚為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上的生長情況

從圖2和圖3可以看出，在以醋酸棉酚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，產(chǎn)朊假絲酵母1087的延緩期較短，培養(yǎng)20 h左右菌液的酵母菌總數(shù)達到最大值，酵母菌1087最高總菌數(shù)達2.25×108個/mL。20—26 h處于穩(wěn)定期。菌液OD值的測定結(jié)果與酵母菌總數(shù)測定結(jié)果基本一致。

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母1087菌株在37℃下的生長曲線

圖3 產(chǎn)朊假絲酵母1087OD600值的變化曲線

2.3 酵母菌固體發(fā)酵結(jié)果

發(fā)酵前后的樣品檢測結(jié)果見表1。發(fā)酵前培養(yǎng)料的粗蛋白含量為17.45%，發(fā)酵后的飼料粗蛋白為23.98%，粗蛋白含量提高了37.4%。發(fā)酵前培養(yǎng)基中游離棉酚含量為186.7 mg/kg，發(fā)酵后飼料樣品的游離棉酚為120 mg/kg，發(fā)酵后飼料中棉酚含量下降了55.6%。發(fā)酵前后粗纖維含量變化不大。對發(fā)酵后樣品的氨基酸含量測定結(jié)果表明(表2)，發(fā)酵后的酵母蛋白飼料樣品的16種氨基酸總和為18.51%，其中賴氨酸含量達1.64%，具有較高的營養(yǎng)價值。

表1 發(fā)酵前后飼料樣品成分檢測結(jié)果

表2 發(fā)酵后飼料樣品16種氨基酸含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

通過比較不同酵母菌在以醋酸棉酚為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上的生長情況，篩選出一株在醋酸棉酚培養(yǎng)基中生長較好的產(chǎn)朊假絲酵母1087。生長曲線測定結(jié)果表明，產(chǎn)朊假絲酵母1087在以醋酸棉酚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，37℃，170 r/min的條件下培養(yǎng)20h總菌數(shù)達到最大值。以棉粕和紅薯渣等為主要原料，接種產(chǎn)朊假絲酵母1087的固體發(fā)酵試驗結(jié)果表明，發(fā)酵后的樣品粗蛋白含量提高了37.4%，棉酚含量下降了55.6%，具有良好的飼用價值。

［1］張文舉，許梓榮，孫建義，等.假絲酵母ZD-3與黑曲霉ZD-8復(fù)合固體發(fā)酵對棉籽餅脫毒及營養(yǎng)價值的影響研究［J］.中國糧油學報，2006，21(6):129-135.

［2］朱德偉，劉志鵬，蔡國林，等.高效降解棉酚菌種的篩選及棉粕發(fā)酵脫毒工藝研究［J］.中國油脂，2010，35(2):24-28.

［3］孫中超，方慧英，諸葛斌，等.高效降解棉酚菌株的分離鑒定及誘變選育［J］.微生物學通報，2011，38(8):1166-1171.

［4］Weng X Y，Sun J Y.Biodegradation of free gossypol by a new strain of Candida tropicalis under solid state fermentation:Effects of fermentation parameters［J］.Process Biochemistry，2006，41(7):1663-1668.

［5］蔡國林，鄭兵兵，陸健，等.微生物發(fā)酵提高花生粕營養(yǎng)價值的初步研究［J］.中國油脂，2010，35(5):31-34.

［6］張昆，王春維，余岳，等.復(fù)合雜粕多菌種發(fā)酵工藝研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2012，(5):49-52.

［7］喬曉艷，蔡國林，陸健.微生物發(fā)酵改善棉粕飼用品質(zhì)的研究［J］.中國油脂，2013，38(5):30-33.

［8］趙斌，何紹江.微生物學實驗［M］.北京:科學出版社，2002.

［9］GB13086—91.飼料中游離棉酚的測定方法［S］.