張鳳雪，徐英武，張智俊，肖冬長，王超莉，屈亞平

（浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300）

毛竹KDO8PS的原核表達純化及晶體生長

張鳳雪，徐英武，張智俊，肖冬長，王超莉，屈亞平

（浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300）

3-deoxy-D-manno-octulosonate（KDO）8-phosphate synthase（KDO8PS）［EC 4.1.2.16］是KDO生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法，以毛竹Phyllostachys edulis新鮮實生苗為材料，分離得到竹子KDO8PS基因。通過對不同物種來源的KDO8PS進行氨基酸序列比對分析和半定量RT-PCR技術(shù)對該基因進行組織特異性表達分析。將PeKDO8PS基因構(gòu)建入原核表達載體pET-28a，并在大腸埃希菌Escherichia coli原核表達系統(tǒng)中獲得了KDO8PS的可溶性高表達。經(jīng)nickel親和層析和分子篩純化2種方法對表達蛋白進行純化。結(jié)果分析表明：該基因編碼區(qū)全長876 bp，可編碼291個氨基酸。PeKDO8PS與擬南芥Arabidopsis thaliana等植物來源的KDSA2的基因有很高序列一致性，而與微生物來源的KDO8PS序列一致性較低。分析毛竹各組織中KDO8PS基因的表達結(jié)果表明，該基因在根、莖和葉片中均有表達，但在根中相對表達量較高，此表達模式亦同擬南芥AtKDSA2類似。另外，發(fā)現(xiàn)KDO8PS在溶液（30mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200mmol·L-1氯化鈉）中以二聚體的形式存在，并且初步篩選出該酶晶體生長條件。此結(jié)果為PeKDO8PS蛋白的最終結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。圖6參12

林木育種學；毛竹；脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶；組織特異性表達；原核表達；蛋白純化；結(jié)晶

果膠是植物中的一種酸性多糖物質(zhì)，主要存在于植物的細胞壁和細胞內(nèi)層，為內(nèi)部細胞的支撐物質(zhì)。果膠類多糖包括三大類：同型半乳糖醛酸聚糖（HG），鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ（RG-Ⅰ）和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（RG-Ⅱ）［1-2］。其中RG-Ⅱ至少有12種不同成分的糖基殘基組成，而2-酮-3-脫氧辛糖酸（KDO）是RG-Ⅱ成分中很少見的八碳糖［3］，其在進化過程中也很保守，對花粉管的生長和伸長具有一定的作用［4-5］。KDO的合成部位為細胞溶膠質(zhì)，合成過程中涉及到5種酶［6］。脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶（3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase，KDO8PS，EC）是參與KDO合成代謝的關(guān)鍵酶之一，催化濃縮磷酸烯醇式丙酮酸與α-阿拉伯糖5磷酸產(chǎn)生2-酮-3-脫氧辛糖8磷酸（3-Deoxy-D-man no-octulosonate 8-phosphate），并釋放無機磷酸（Pi）。產(chǎn)物2-酮-3-脫氧辛糖-8磷酸是2-酮-3-脫氧辛糖酸的前體。最初研究發(fā)現(xiàn)，在所有的革蘭氏陰性菌中（Gˉ），2-酮-3-脫氧辛糖酸是脂多糖組分中必需的八碳糖，它連接類脂A與O-特異側(cè)鏈共同嵌入細胞壁的外膜上，其中類脂A是內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)，O-抗原的多樣性決定了Gˉ表面抗原決定簇的多樣性，脂多糖（LPS）具有控制著某些物質(zhì)進出細胞的部分選擇性屏障功能［7］。此后又發(fā)現(xiàn)，2-酮-3-脫氧辛糖酸也是高等植物細胞壁以及一些綠色藻類植物細胞壁多糖的成分［3,8］。大腸埃希菌Escherichia coli中，KDO8PS晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，它是一個不對稱同源四聚體，其中每個單體都含有（β/α）8桶狀折疊［9］，在擬南芥Arabidopsis thaliana中分離到2個編碼KDO8PS的旁系同源基因AtkdsA1和AtkdsA2［10］，相對于莖干、幼嫩的葉、成熟的葉，成熟花中AtkdsA2基因的表達量明顯增高，對花粉管的生長和伸長具有一定的作用，并發(fā)現(xiàn)KDO8PS在水溶液中主要是以二聚體形式存在［11］。但是由于在植物中KDO8PS晶體結(jié)構(gòu)尚未解析，酶功能及催化作用機制、不同生物來源KDO8PS酶的催化特性等科學問題仍需深入研究。中國是竹子大國，竹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展蘊藏著巨大的經(jīng)濟效益，其中食用竹筍擁有豐富的營養(yǎng)價值，被公認為是最佳的綠色食品、經(jīng)濟價值高［12］。在眾多竹類中，毛竹Phyllostachys edulis是中國竹類植物中分布范圍最廣、栽培面積最大、蓄積量最多、經(jīng)濟價值最高的一個材用和筍用竹種，在中國林業(yè)生產(chǎn)中占有非常重要的地位。本研究擬克隆毛竹脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因，分析其在毛竹不同組織表達特異性，進行進化系統(tǒng)分析和在原核細胞中過量表達，經(jīng)過親和層析和分子篩層析純化得到高純度蛋白，用于培養(yǎng)晶體。實驗結(jié)果顯示：該蛋白在溶液中是以二聚體形式存在，并篩選出微晶，為解析其晶體結(jié)構(gòu)和揭示其酶催化機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

克隆基因所用材料取自浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地培養(yǎng)室內(nèi)半年生毛竹Phyllostachys edulis實生苗；分別取新鮮、無病蟲害的根、莖和葉，液氮速凍-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑核糖核酸（RNA）提取試劑/Trizol購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；AMV酶反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Bam HI，EcoRI，T4DNA ligase酶和pMD18-T simple vector購自寶生物工程有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；大腸埃希菌菌株DH5α，RosettaTM（DE3），BL21（DE3）和pET-28a質(zhì)粒（浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地改造后的質(zhì)粒）載體為浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地所保存。

1.2.2 毛竹幼苗RNA的提取和cDNA的合成取新鮮、無病蟲害的根、莖和葉，液氮中迅速研磨成粉末，采用RNA提取試劑盒提取RNA，用DNaseI酶消除RNA中的DNA。分別以毛竹根、莖、葉以及總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第1條鏈。

1.2.3 PeKDO8PS基因克隆通過美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得雙子葉植物擬南芥，水稻Oryza sativa的KDO8PS基因序列，根據(jù)該基因的開放閱讀框（ORF）區(qū)以及氨基酸序列比對獲得聚合酶鏈式反應（PCR）引物：上游Bam HI酶切位點引物A 5′-CGGGATCCATGGATGCTTCGTCC-3′和下游Eco RI酶切位點引物B 5′-GGAATTCTCATTCCTGGAATGGAGTGAGGT-3′（酶切位點用下劃線顯示），由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。以毛竹實生苗總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，利用A和B特異性引物進行擴增。PCR產(chǎn)物電泳分析后經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收，利用Bam HI和Eco RI限制性內(nèi)酶切雙酶切PCR產(chǎn)物，獲得的目的DNA片段插入經(jīng)同樣酶切后的pET-28a（+）表達載體，得到1個N-末端含有6個His親和標簽的重組子。將重組質(zhì)粒經(jīng)熱擊轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌菌株DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定陽性克隆，同時提取陽性克隆質(zhì)粒進行雙酶切和單酶切驗證，經(jīng)生工生物工程有限公司測序。1.2.4 PeKDO8PS基因的組織特異性表達檢測采用RT-PCR法確定PeKDO8PS基因在不同器官中的表達量。以毛竹Actin基因作為內(nèi)參，PCR反應條件：94℃5 min 1個循壞；94℃30 s,58℃30 s,72℃45 s，28個循環(huán)；72℃8 min，可獲得150 bp左右的DNA片段。目的基因（上游引物5′-ATGGATGCTTCGTCCGTGG-3′和下游引物5′-CTAGACCAGGACCACGGAAGG-3′）經(jīng)RT-PCR可獲得300 bp左右的目的產(chǎn)物，PCR反應條件選擇循環(huán)次數(shù)在線性范圍內(nèi)，且電泳效果好的次數(shù)作為最佳循環(huán)次數(shù)。

1.2.5 PeKDO8PS的原核表達重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達菌株RosettaTM（DE3）和BL21（DE3），從抗卡那氯霉素養(yǎng)平板上挑取單克隆，接入2 mL LB液體培養(yǎng)基（K+）37℃培養(yǎng)，當菌體OD600達到0.7時，其中一部分加入0.4mmol·L-1IPTG誘導，在37℃搖床上誘導3 h，收集菌體。另一部分加入0.4mmol·L-1IPTG誘導，在20℃搖床上誘導14 h，收集菌體。超聲（開/關(guān)5 s/6 s，總時間1 min，功率20%）破碎，SDS-PAGE檢測蛋白表達及可溶性情況。

1.2.6 PeKDO8PS的大量表達純化將收集的菌體重懸在25 m L裂解緩沖液（30 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1氯化鈉）中，加入500 g·kg-1甘油至終質(zhì)量分數(shù)50 g·kg-1，超生破碎（開/關(guān)8 s/8 s，總時間15 min，功率40%），4℃，17 000 r·min-1離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至鎳柱（預先用超聲buffer平衡），在冰上結(jié)合0.5～1.0 h后，用Buffer A（30mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200mmol·L-1氯化鈉,50 mmol·L-1咪唑）洗雜蛋白，用Bradford試劑粗略檢測至無顏色變化，Buffer B（30mmol·L-1Tris-HClpH 8.0,200mmol· L-1氯化鈉,200 mmol·L-1咪唑）洗脫目的蛋白。將洗脫的目的蛋白在10 kDa濃縮柱中濃縮至500μL左右。分子篩層析柱Superose 12 10/300 GL用Buffer C（30mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200mmol·L-1氯化鈉）平衡，將濃縮的蛋白上樣，根據(jù)出峰的順序，在目標蛋白峰處每500μL收集1管，SDS-PAGE檢測每管的純度，將純度高的蛋白組份濃縮到10 g·L-1（紫外280 nm分光光度檢測），-80℃保存。

1.2.7 蛋白晶體生長條件篩選采用懸滴法初篩晶體的生長條件。初次篩選的條件是用Emerald Biosystems公司的WizardTMⅠ，WizardTMⅡ，WizardTMⅢ和WizardTMⅣ試劑盒，共有192個篩選條件。采用24孔蛋白結(jié)晶培養(yǎng)板，池液350μL，蛋白液和池液以1∶1比例混合，點樣，密封蓋玻片，置于20℃進行晶體培養(yǎng)。晶體生長情況可以在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因保守區(qū)片段的克隆、分析及原核表達載體的構(gòu)建

經(jīng)克隆后重組測序，獲得開放閱讀框為876 bp的目的片段，應用Blast在線軟件與已報道的基因進行同源比較，發(fā)現(xiàn)插入片段與脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因家族NeuB超家族的保守區(qū)有較高的相似性，其中與水稻的一致性達95%，與擬南芥脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因一致性達84%，初步確定為毛竹脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因的序列，此基因編碼291個氨基酸（圖1），第260～270位為脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶保守區(qū)，等電點為7.7，分子量為31 656.45 Da。

2.2 PeKDO8PS氨基酸序列比較與系統(tǒng)進化樹分析

通過Blast軟件在線分析，結(jié)果顯示：PeKDO8PS編碼的氨基酸序列與單子葉植物的KDSA具有較高的一致性，尤其與同是禾本科Poaceae的水稻玉米Zeamays和二穗短柄草Brachypodium distachyon的一致性較高，其中與水稻的一致性達95%，與小立碗蘚屬Physcomitrella的一致性為76%。由此可見：KDO8PS在進化系統(tǒng)中是比較保守的。采用MEGA5軟件構(gòu)建了基于KDSA編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹（圖2）。分析表明：系統(tǒng)樹明顯分為三大支，其中竹子與水稻、玉米位置較近，位于同一個分支上；與擬南芥位于同一大分支上，與大腸埃希菌和風產(chǎn)桿菌分支最遠。

圖1 毛竹PeKDO8PS基因ORF區(qū)及預測的氨基酸序列Figure 1 ORF of PeKDO8PS gene and the corresponding amino acid sequence

圖2 基于不同植物KDO8PS氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Figure 2 Phylogenetic tree of KDO8PS from differentplants

2.3 PeKDO8PS基因組織表達特異性分析

分別提取毛竹根、莖和幼葉的RNA，經(jīng)分光光度法檢測，D（260）/D（280）為1.8～2.0，D（260）/D（280）大于2.3，表明RNA質(zhì)量高，可用于進一步分析。反轉(zhuǎn)錄cDNA時，用毛竹actin基因作為內(nèi)參，調(diào)整cDNA用量和循環(huán)數(shù)，使目的基因擴增時內(nèi)參基因的表達豐度一致。半定量PCR結(jié)果表明：PeKDO8PS基因在根、莖和幼葉中均有表達，其中在根中的表達豐度最高，莖次之，在幼葉中的表達豐度最低（圖3）。

2.4 PeKDO8PS重組蛋白的純化及表達檢測

重組載體轉(zhuǎn)化表達菌株RosettaTM（DE3）和BL21（DE3）感受態(tài)細胞，誘導表達后，取10mL誘導菌體和未誘導菌體，超生破碎后，4℃,17 000 r·min-1離心30 min，分別取上清、沉淀，加入上標緩沖液，95℃變性后，SDS-PAGE變性膠電泳分析，在電泳圖譜發(fā)現(xiàn)1條明顯的表達條帶，接近理論分子量33 kDa，并且對比分析發(fā)現(xiàn)表達菌株RosettaTM（DE3）在20℃培養(yǎng)溫度下表達量相對高些，有助于減少重組蛋白包涵體的形成，故在后續(xù)試驗中確定表達菌株RosettaTM（DE3）在20℃為重組蛋白誘導表達的最佳條件（圖4左圖）。

圖3 毛竹KDO8PS基因在根、莖、葉中的表達Figure 3 Tissue specific expression analysis of PeKDO8PS in root,stem,and leaf

圖4 PeKDO8PS分別在表達菌株RosettaTM（DE3）和BL21（DE3）中的表達（左圖）和PeKDO8PS分子篩層析后，分管收集蛋白SDS-PAGE電泳圖（右圖）Figure 4 Prokaryotic expression of PeKDOPSin RosettaTM（DE3）and BL21（DE3）cells（left）and SDS-PAGE analysis of PeKDO8PS（right）

2.5 PeKDO8PS蛋白的分子篩層析

因水溶液中BSA分子之間快速可逆自聚可形成少量的BSA二聚體，所以BSA是一個很好的標記物。經(jīng)Superose 12 10/300 GL層析后，對比BSA洗脫體積和分子量關(guān)系可知,目的蛋白峰位置所對應的分子量大小在BSA單體（66.43 kDa）位置，初步確定其為二聚體（63.3 kDa，圖5），并且重組蛋白只出現(xiàn)明顯的單峰，說明蛋白的均一性很好，收集目的蛋白，500μL為1管，用于電泳檢測和晶體生長。

2.6 PeKDO8PS蛋白SDS-PAGE檢測

分子篩層析后分管收集的蛋白變性后用120 g·kg-1聚丙烯酰胺凝膠變性電泳檢測，結(jié)果顯示蛋白分子量為33 kDa（圖4右圖），純度為95%以上，可用于蛋白晶體生長。

2.7 PeKDO8PS蛋白晶體篩選結(jié)果

收集的蛋白濃縮至30 g·L-1，可用于蛋白晶體生長。2 d后蛋白2種條件中長出了長條狀晶體（圖6），2種條件分別是100 g·L-1PEG 3000，0.1 mol·L-1Cacodylate（pH 6.5），0.2·L-1氯化鎂；2.5·L-1氯化鈉,Na/K phosphate（pH 6.2）。但形狀并不相同。經(jīng)考馬斯亮藍試劑染色，晶體為淡藍色，說明是蛋白晶體。優(yōu)化工作正在進行中。

3 討論

毛竹KDO8PS編碼的蛋白序列與擬南芥KDO8PS的一致性達84%，與大腸埃希菌KDO8PS一致性達49%，同屬于NeuB超家族。系統(tǒng)進化分析顯示，毛竹與水稻和玉米位置較近，位于同一個分支上；與擬南芥位于同一大分支上，與大腸埃希菌和風產(chǎn)桿菌Aquifex aeolicus分支最遠。KDO8PS基因在植物組織中的表達具有組織特異性。本研究中，PeKDO8PS基因在根、莖和幼葉中均有表達，在根中的表達豐度較高，但在幼葉中的表達豐度最低，這與擬南芥中KDSA2表達模式相同［10］，進一步推測竹子KDO8PS基因與擬南芥中KDSA2基因可能具有相似功能。本研究目前得到的KDO8PS晶體較小，結(jié)晶條件有待進一步優(yōu)化。N端His標簽的引入也可能增加蛋白分子柔性，不利于晶體生長［12］。后續(xù)實驗將繼續(xù)優(yōu)化結(jié)晶條件，并通過酶法切除His標簽，以提高晶體質(zhì)量。

圖6 PeKDO8PS蛋白晶體Figure 6 Protein crystallization of PeKDO8PS

自2000年大腸埃希菌的KDO8PS結(jié)構(gòu)公布后，又陸續(xù)有其他微生物的KDO8PS結(jié)構(gòu)得到報道。但是植物來源KDO8PS結(jié)構(gòu)至今仍未被解析，僅在擬南芥相關(guān)研究中表明KDO8PS在溶液中呈現(xiàn)二聚體的形式［11］。在本研究中出現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象：我們實驗室首次獲得擬南芥脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶（KDO8PS）晶體，并解析其衍射精度2.1×10-10m的三維空間結(jié)構(gòu)，其三維結(jié)構(gòu)為不對稱同源四聚體（文章待發(fā)表），這與大腸埃希菌的KDO8PS的不對稱同源四聚體結(jié)構(gòu)相似，雖與C-末端存在一定差異。但從分子篩以及戊二醛交聯(lián)結(jié)果可知，擬南芥KDO8PS在溶液中以二聚體形式存在，這種情況可能是兩兩環(huán)抱的二體聚合，在X射線照射下呈現(xiàn)四聚體。而對于純化過程中的毛竹KDO8PS，從分子篩的圖形中估計也是以二聚體形式存在。因此，為了進一步了解單子葉和雙子葉植物KDO8PS結(jié)構(gòu)上的差異，還需獲得毛竹KDO8PS較高精度的三維結(jié)構(gòu)，并與擬南芥KDO8PS的三維結(jié)構(gòu)進行比較。

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Expression,purification,and crystallization of KDO8PS from Phyllostachys edulis

ZHANG Fengxue,XU Yingwu,ZHANG Zhijun,XIAO Dongchang,WANG Chaoli,QU Yaping
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300，Zhejiang，China）

3-deoxy-D-manno-octulosonate（KDO）8-phosphate synthase（KDO8PS）［EC 4.1.2.16］is the ratelimiting enzyme in the KDO biosynthetic pathway.In this study,the KDO8PS gene（3-deoxy-d-manno-octulosonate-8-phosphate synthase）was cloned from freshPhyllostachys edulisseedlings using Reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.Amino acid sequence alignment analysis of the KDO-8P synthase from different organisms and tissue specific expression analysis by semi-quantitative RT-PCR were conducted. After,PeKDO8PSwas recombined into the expressed pET-28a vector and over expressed inEscherichia coli.Then the fusion protein was purified through using a two-steps purification strategy including nickel affinity and size exclusion chromatography（SEC）.Results showed that the open reading frame was 876 bp encoding a protein consisting of 291 amino acid residues.The PeKDO-8P synthase had high similarity with KDO-8P synthase from plants such as AtkdsA2 fromArabidopsis thaliana,while low identities from microorganism.The tissue specific expression analysis showed much higher gene expression in roots than in stems and leaves which was similar toAtkdsA2fromArabidopsis thaliana.Finally,the chromatography analysis showed that the PeKDO8PS protein mainly existed as dimmer in 30 mmmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1NaCl,from which thegrowth of preliminary screening protein crystallization condition was obtained.These works provide the first step for its structure determination.［Ch,6 fig.12 ref.］

forest tree breeding；Phyllostachys edulis;3-deoxy-D-manno-octulosonate（KD0）8-phosphate synthase（KDO8PS）；tissue-specific expression;prokaryotic expression；protein crystallization；crystal

S722.3

A

2095-0756（2014）04-0515-06

2013-10-21；

2014-01-13

國家自然科學基金資助項目（31270715）；浙江農(nóng)林大學科研發(fā)展基金資助項目（2010FR072）

張鳳雪，從事生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：xiaoxue_kuaile@163.com。通信作者：張智俊，副教授，博士，從事生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：397942805@qq.com