李兵娟，肖國(guó)輝，許在恩，郭小勤

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300）

新開發(fā)的禾本科通用性分子標(biāo)記的檢測(cè)與評(píng)估

李兵娟，肖國(guó)輝，許在恩，郭小勤

（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安 311300）

為開發(fā)更多的適用于禾本科Poaceae植物通用性分子標(biāo)記，豐富竹類植物的遺傳信息，依據(jù)禾本科單拷貝同源基因（COSⅡ）已知序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了14對(duì)引物，以此引物對(duì)剛竹屬Phyllostachys植物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，并對(duì)部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果所有引物可以在至少1個(gè)材料中得到特異性擴(kuò)增，其中7對(duì)引物在5個(gè)供試材料中均能擴(kuò)增到產(chǎn)物，13對(duì)引物在5個(gè)樣本中表現(xiàn)出多態(tài)性，占引物總數(shù)的92.9%。對(duì)部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)序列均為特異性擴(kuò)增序列。同一引物在不同樣本中的擴(kuò)增片段間存在單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，部分SNP位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致氨基酸序列提前終止或酶切位點(diǎn)變化。對(duì)有合適內(nèi)切酶存在的變異位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。利用NTsys 2.10e軟件，對(duì)5個(gè)供試竹種材料進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，毛竹Phyllostachys edulis與綠粉竹Phyllostachys virdiglaucescens親緣關(guān)系最近,紫竹Phyllostachys nigra與其他4個(gè)竹種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。所開發(fā)的14個(gè)COSⅡ引物在剛竹屬植物中具一定通用性，同時(shí)挖掘出更多竹類植物中的遺傳信息。圖4表4參22

植物學(xué)；竹類植物；通用性分子標(biāo)記；單拷貝同源基因（COSⅡ）；單核苷酸多態(tài)（SNP）；PCR-RFLP

竹類植物屬單子葉禾本科Poaceae植物，具重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。全世界木本竹類有70多屬1 200余種［1］。中國(guó)是竹類資源最豐富的國(guó)家，素有“竹子王國(guó)”之稱［2］。雖然已對(duì)毛竹Phyllostachys edulis基因組進(jìn)行了測(cè)序［3］，但關(guān)于竹類植物的研究仍集中在分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用，功能基因的分離與生物學(xué)功能鑒定及高通量的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等［4-8］。目前，竹類植物中所開發(fā)的分子標(biāo)記基本以未知序列為主，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD），限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）等［4］，因此，開發(fā)出功能基因的分子標(biāo)記用于比較基因組學(xué)及竹類植物中功能基因的挖掘日益重要。在許多植物類群的研究中，低拷貝的核內(nèi)基因相比能提供更多的信息位點(diǎn)，具備更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)［9-12］。Wu等［13］首次基于茄科Solanaceae植物開發(fā)出單拷貝直系同源基因（single-copy orthologous genes，COSⅡ）分子標(biāo)記，并成功用于茄科植物間的同線性研究［14-15］。該標(biāo)記是基于核基因內(nèi)保守的直系同源基因開發(fā)出來的一種新型分子標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低。一般來說，COS標(biāo)記位點(diǎn)都位于編碼區(qū)，通常涉及的基因是編碼生命必需的酶、輔酶或關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的基因，具有很高的保守性。COS標(biāo)記的開發(fā)對(duì)于比較作圖，線性同向序列分析，系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和分子進(jìn)化等方面的研究具有重要意義［16］。禾本科是種子植物中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的。該科中水稻Oryza sativa，高粱Sorghum bicolor和玉米Zeamays等的基因組序列相繼公布，基于這些基因組序列，Liu等［17］共鑒定出2～684個(gè)COSⅡ基因，并開發(fā)出1 072個(gè)COSⅡ分子標(biāo)記，該標(biāo)記在竹類植物中具有較好的通用性。毛竹基因組序列雖已測(cè)序，但仍有部分基因未能獲得。因此，為開發(fā)更多的適用于禾本科植物通用性分子標(biāo)記，豐富竹類植物的遺傳信息，我們采用同樣的方法開發(fā)了14對(duì)COSⅡ引物，在剛竹屬Phyllostachys植物中進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)部分?jǐn)U增結(jié)果進(jìn)行了測(cè)序，并對(duì)其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)進(jìn)行了分析和驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

選取竹亞科Bambusoideae的5個(gè)竹種進(jìn)行試驗(yàn)（表1）。供試材料都采自浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園。竹葉采集時(shí)間為2012年4月，所采集的樣本均通過形態(tài)學(xué)鑒定，采集后用液氮速凍，放入-70℃冰箱保存。大腸埃希菌菌株Escherichia coli DH-5α和質(zhì)?；厥赵噭┖匈?gòu)自于生工生物工程（上海）有限公司。載體、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。膠回收試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 葉片總RNA及基因組DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取5個(gè)竹種葉片基因組DNA［18］。

1.2.2 COSⅡ引物設(shè)計(jì)參照Liu等［17］的方法，基于禾本科植物中COSⅡ基因序列設(shè)計(jì)了14對(duì)引物，引物序列及其在水稻中序列號(hào)如表2。

1.3 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增

取各竹種葉片約2.0 g，采用改良CTAB法提取葉片總DNA。PCR反應(yīng)體系總體積為10.0μL，其中含50 ng模板DNA；上游、下游引物各0.5μmol·L-1；200.0μmol·L-1三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP）；1.0μmol·L-1Taq DNA聚合酶；1.0μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液（內(nèi)含氯化鎂）。采用降落PCR技術(shù)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s（遞減0.3℃·循環(huán)-1），72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。組合至少重復(fù)2次·引物-1，以確保擴(kuò)增結(jié)果的可靠性。擴(kuò)增產(chǎn)物在體積分?jǐn)?shù)為6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上，穩(wěn)壓200 V，電泳80min。對(duì)膠染色，對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離后的目的片段確認(rèn)拍照。

表1 供試樣本材料Table 1 Samples used in the study

表2 引物序列Table2 Primer sequences of the 14 COSⅡmarkers

1.4 擴(kuò)增結(jié)果的統(tǒng)計(jì)及遺傳進(jìn)化關(guān)系的分析

以相同遷移位置記作1個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，記錄每對(duì)引物在5個(gè)材料中PCR擴(kuò)增獲得的位點(diǎn)總數(shù)Nt；5個(gè)材料中擴(kuò)增獲得的位點(diǎn)數(shù)Nb；及多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)Np。在每個(gè)引物的相同遷移位點(diǎn)上，以“1”或“0”記錄條帶信息，其中“1”代表有擴(kuò)增產(chǎn)物，“0”代表無擴(kuò)增產(chǎn)物，建立一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣。把距離矩陣輸入NTedit軟件中，用Ntsys模型構(gòu)建樹狀聚類圖。

1.5 序列測(cè)定、SNP檢測(cè)及RFLP驗(yàn)證

將PAGE電泳后的目的條帶進(jìn)行割膠回收，將其作為第2次PCR的模板，將2次PCR產(chǎn)物割膠回收再測(cè)序，對(duì)所得序列采用軟件DNAMAN進(jìn)行比較，分析單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。應(yīng)用內(nèi)切酶SacⅠ分別對(duì)引物1在5個(gè)竹種的PCR產(chǎn)物回收進(jìn)行酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系及條件為PCR產(chǎn)物6.0μL，緩沖液1.0μL，內(nèi)切酶0.5μL，雙蒸水2.5μL，混勻，37℃水浴12 h，20.0 g·kg-1瓊脂糖電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增結(jié)果

利用新設(shè)計(jì)的14對(duì)引物分別對(duì)5個(gè)竹種進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：12對(duì)引物可以在至少3個(gè)材料中得到特異性PCR產(chǎn)物，其中7對(duì)引物在5個(gè)供試材料中均能擴(kuò)增到產(chǎn)物（表3）。在可擴(kuò)增出產(chǎn)物的引物中，有13對(duì)引物（92.9%）在供試材料中表現(xiàn)出多態(tài)性，僅引物11在供試材料間沒有多態(tài)性位點(diǎn)。對(duì)引物1從雷竹、毛竹、黃稈烏哺雞竹、紫竹、綠粉竹中擴(kuò)增的條帶進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序片段的長(zhǎng)度除綠粉竹是347 bp，其余都是363 bp（圖1）。綠粉竹與其他竹種間序列大小間的差異主要是由于該基因內(nèi)含子長(zhǎng)度不一造成的。而且毛竹中獲得的序列與http://202.127.18.221/bamboo/網(wǎng)站上的序列完全一致。將所測(cè)序列與水稻序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的序列與水稻序列間的同源性均達(dá)到92.77%以上，且在外顯子部分高度保守，內(nèi)含子表現(xiàn)出較大的差異，表明它們均為水稻的同源目標(biāo)基因（圖2）。對(duì)引物2從5個(gè)樣本中擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行測(cè)序，所得片段長(zhǎng)度均為132 bp（圖1），分析發(fā)現(xiàn)該段序列不包含內(nèi)含子。同樣，從毛竹中獲得的序列與美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上的序列完全一致。對(duì)所獲得的序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)獲得的4條序列與水稻中該基因序列間的差異非常小，彼此之間的同源性均達(dá)到97.24%。

若按所用14對(duì)COSⅡ引物所在基因編碼產(chǎn)物的功能進(jìn)行分類，可將它們大致分為5類，分別為蛋白質(zhì)修飾、細(xì)胞成分組裝、代謝、生化過程及其他。從拷貝數(shù)來看，這些引物所在基因在水稻中均為單拷貝，但本研究的結(jié)果顯示，在所擴(kuò)增的樣本中同樣表現(xiàn)出單拷貝的特性。有些引物在某些供試材料所擴(kuò)增出的位點(diǎn)有些具多態(tài)性，有些位點(diǎn)不具有多態(tài)性。

表3 不同引物在5個(gè)供試樣本中的擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Resultsobtained by PCR with COSⅡprimers in samples tested

2.2 供試材料的聚類分析

利用14對(duì)COSⅡ標(biāo)記引物在這些試驗(yàn)材料中擴(kuò)增共得到56個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。根據(jù)帶型的不同，計(jì)算試驗(yàn)材料間的遺傳距離。根據(jù)遺傳距離，利用NTsys 2.10e軟件，得到5個(gè)樣本的聚類圖（圖3），紫竹與其他4個(gè)竹種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，毛竹與綠粉竹親緣關(guān)系最近。該結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果吻合。

圖1 2對(duì)引物在5個(gè)竹種的擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR products of primer 1 and primer 2 in the 5 bamboo species separated by 6%non-denaturing PAGE gel

2.3 擴(kuò)增片段單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析

序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，所擴(kuò)增的序列存在豐富的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。引物1所獲序列的編碼區(qū)（259 bp）存在41個(gè)SNP位點(diǎn)，多態(tài)性頻率為1 SNP/6.3 bp，其中轉(zhuǎn)換型SNP占90%，顛換型SNP占10%（圖2）。對(duì)引物1所編碼的氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)9處SNP引起氨基酸的變異，且第61堿基處的T/C轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致雷竹氨基酸序列的提前終止；第151堿基處的T/C轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致毛竹氨基酸序列的提前終止。有些SNP位點(diǎn)也會(huì)引起酶切位點(diǎn)的變異，如第96堿基處的T/C轉(zhuǎn)換導(dǎo)致毛竹SacⅠ（GAGCTC）酶切位點(diǎn)的消失（圖4）。引物2所獲序列（132 bp）共存在7個(gè)SNP位點(diǎn)，多態(tài)性頻率為1 SNP/19 bp，其中2個(gè)轉(zhuǎn)換型，5個(gè)顛換型，這7個(gè)SNP引起2個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變（表4）。

2.4 PCR-RFLP驗(yàn)證

引物1的擴(kuò)增產(chǎn)物間存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，為了驗(yàn)證SNP的可靠性，采用限制性內(nèi)切酶SacⅠ對(duì)引物1在5個(gè)竹種的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切檢測(cè)，結(jié)果顯示：從毛竹中獲得的片段不能被內(nèi)切酶SacⅠ切開，的確在該酶切位點(diǎn)發(fā)生了變異，其余竹種的擴(kuò)增產(chǎn)物在該位點(diǎn)均能被切為2條帶，且2條帶大小之和與原來的條帶大小吻合，電泳檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致（圖4）。

圖2 引物1擴(kuò)增產(chǎn)物的序列比對(duì)Figure 2 Multiple alignmentof the Oryzasativa gene（LOC_Os12g0527850）and thesequencesof the5 bamboo speciesbased on theprimer1

圖3 5個(gè)供試樣本的聚類圖Figure 3 A dendrogram of samples based on 14 COSⅡmarkers

表4 引物2所擴(kuò)增片段單核甘酸變異Table 4 Variation of single nucleotides in the segment of primer 2

3 討論

COSⅡ標(biāo)記位點(diǎn)是物種進(jìn)化上相對(duì)保守的位點(diǎn)，可用于不同的基因組之間比較作圖，構(gòu)建種間線性遺傳圖譜和分析遺傳關(guān)系。本研究參照Liu等［17］的方法，依據(jù)禾本科植物中COSⅡ基因序列設(shè)計(jì)了14對(duì)引物。利用這14對(duì)引物分別對(duì)5個(gè)竹種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：11對(duì)引物可以在至少3個(gè)材料中得到特異性PCR產(chǎn)物，其中7對(duì)引物在5個(gè)供試材料中均能擴(kuò)增到產(chǎn)物。選取2對(duì)引物的擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序，相同引物擴(kuò)增出的序列均為水稻的同源目的序列。引物1在5個(gè)樣本中獲得的序列間存在明顯差異，除內(nèi)含子序列差異較大外，在外顯子區(qū)域也存在豐富的SNP變異位點(diǎn)。這些SNP位點(diǎn)或者引起氨基酸位點(diǎn)變異，或者引起酶切位點(diǎn)變異，甚至?xí)?dǎo)致氨基酸序列的提前終止，如擴(kuò)增序列中第96堿基處的差異導(dǎo)致毛竹SacⅠ（GAGCTC）酶切位點(diǎn)；第61和151堿基處的T/C轉(zhuǎn)換，分別導(dǎo)致雷竹與毛竹氨基酸序列的提前終止。我們還對(duì)供試材料進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果與形態(tài)學(xué)聚類結(jié)果一致，表明開發(fā)的14對(duì)COSⅡ引物在在剛竹屬植物中具有一定的通用性。

圖4 用SacⅠ酶切檢測(cè)結(jié)果Figure 4 PCR productsof primer1 in the 5 bamboo samples was digested with restriction enzyme SacⅠ

SNP是可以鑒定種下等級(jí)的最為精確的分子標(biāo)記，可用于對(duì)親緣關(guān)系較近的近緣種及不同基因型的品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。由于SNP存在于整個(gè)基因組中，在許多重要基因座或鄰近區(qū)，比其他類型分子標(biāo)記更能提供更多的特殊性標(biāo)記，可以更直接、快捷地用于分子育種［19］。SNP位點(diǎn)的可靠性一般用PCR-RFLP方法驗(yàn)證，此方法對(duì)外形上易混淆種類的鑒定具有準(zhǔn)確、快速、價(jià)廉和重現(xiàn)性好等的優(yōu)點(diǎn)。本研究所測(cè)的引物1和引物2的擴(kuò)增產(chǎn)物存在豐富的SNP位點(diǎn)，這一結(jié)果與竹類植物基因間存在豐富的SNP位點(diǎn)相吻合［3,19］。Germano等［20］通過PCR-RFLP方法鑒定出3個(gè)云杉Picea近緣種間的多態(tài)性。張婷等［21］采用該方法鑒別了藥用植物束花石斛Dendrobium chrysanthum，流蘇石斛Dendrobium fimbriatum及其形態(tài)相似種；曹東偉等［22］用該技術(shù)分析了中國(guó)櫻桃Prunus pseudocerasus分子親緣地理學(xué)研究。本研究亦采用PCR-RFLP方法對(duì)引物1所擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，并鑒定出了毛竹和綠粉竹2個(gè)相似種。由此，本研究所獲得的標(biāo)記在竹類植物中通用，并有望開發(fā)成SNP標(biāo)記而將不同竹種分開。

［1］馬乃訓(xùn)，陳光才，袁金玲.國(guó)產(chǎn)竹類植物生物多樣性及保護(hù)策略［J］.林業(yè)科學(xué)，2004，43（4）：103-106.

MA Naixun,CHEN Guangcai，YUAN Jinling.Bamboo biodiversity and conservation strategies in China［J］.Sci Silv Sin，2004，43（4）：103–106.

［2］王樹東.淺析竹業(yè)發(fā)展與打造竹產(chǎn)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)［J］.林業(yè)科技管理，2004（3）：12-13.

WANG Shudong.A discussion on the development of bamboo industry and the establishment of economic circulation of bamboo industry［J］.For Sci&Technol Manage，2004（3）：12-13.

［3］PENG Zhenhua，LU Ying，LI Lubin，et al.The draft genome of the fast-growing non-timber forest speciesmoso bamboo（Phyllostachys heterocycla）［J］.Nat Gen，2013，45（4）：456-461.

［4］江澤慧.竹類植物基因組學(xué)研究進(jìn)展［J］.林業(yè)科學(xué)，2012，48（1）：160-166.

JIANG Zehui.Progress in bamboo genomics research［J］.Sci Silv Sin，2012，48（1）：160-166.

［5］GAO Zhimin，LICaili，PENG Zhenhua.Generation and analysis of expressed sequence tags from a normalized cDNA library of young leaf from Ma bamboo（Dendrocalamus latiflorusMunro）［J］.Plant Cell Rep，2011，30（11）：2045-2057.

［6］CAIZhaoming，ZHANG Yuxiao，ZHANG Lina，et al.Testing four candidate barcodingmarkers in temperate woody bamboos（Poaceae:Bambusoideae）［J］.JSyst Evol，2012，50（6）：527-539.

［7］ZHANG Yuxiao，ZENG Chunxia，LIDezhu.Complex evolution in Arundinarieae（Poaceae:Bambusoideae）：incongruence between plastid and nuclear GBSSIgene phylogenies［J］.Mol Phyl Evol，2012，63（3）：777-797.

［8］ZHANG Xuemei，ZHAO Lei，ZACGARY L R，et al.De Novo Sequencing and characterization of the floral transcriptome ofDendrocalamus latiflorus（Poaceae：Bambusoideae）［J］.PLoSONE，2012，7（8）：e42082.doi:10.1371/ journal.pone.0042082.

［9］SANG T.Utility of low-copy nuclear gene sequences in plantphylogenetics［J］.CritRev Biochem Mol Biol，2002，37：121-147.

［10］SMALLR L，CRONN R C，WENDEL JF.Use of nuclear genes forphylogeny reconstruction in plants［J］.Aust Syst Bot，2004，17：145-170.

［11］LIMingai，WUNDER J，BISSOLIG，et al.Development of COS genes asuniversally amplifiablemarkers for phylogenetic reconstructions ofclosely related plant species［J］.Cladistics，2008，24：727-745.

［12］ALVAREZ I，COSTA A，NIETO F G.Selecting single-copy nucleargenes for plant phylogenetics：a preliminary analysis for the Senecioneae（Asteraceae）［J］.JMol Evol，2008，66：276-291.

［13］WU Feinan，MUELLER L A，CROUZILLATD，et al.Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes（COSⅡ）for comparative，evolutionary and systematic studies：a test case in the euasterids plant clade［J］.Theor Appl Genet，2007，115：747-755.

［14］WU Feinan，EANNETTA N T，XU Yimin，et al.A COSⅡgenetic map of the pepper genome provides a detailed picture of synteny with tomato and newinsights into recent chromosome evolution in the genus Capsicum［J］.Theor Appl Genet，2009，118：1279-1293.

［15］WU Feinan，EANNETTA N T，XU Yimin，et al.A detailed synteny map of the eggplant genome based on conserved ortholog set II（COSⅡ）markers［J］.Theor Appl Genet，2009，118：927-935.

［16］FULTON T M，der HOEVEN R V，EANNETTA N T，et al.Identification，analysis，and utilization of conserved ortholog setmarkers for comparative genomics in higher plants［J］.Plant Cell，2002，14：1457-1467.

［17］LIU Hailan，GUO Xiaoqin，WU Jiasheng，et al.Development of universal genetic markers based on single-copy orthologous（COSⅡ）genes in Poaceae［J］.Plant Cell Rep，2013，32（3）：379-388.

［18］MURRAY M G，THOMPSONW F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］.Nucleic Acids Res，1980，8（19）：4321-4325.

［19］肖國(guó)輝，王弋，郭小勤，等.紫竹不同栽培類型PPO基因片段克隆及其SNP分析［J］.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30（4）：511-516.

XIAO Guohui，WANG Yi，GUO Xiaoqin，et al.Cloning and SNP analysis of PPO gene among cultivars ofPhyllostachys nigra［J］.JZhejiang A&FUniv，2013，30（4）：511-516.

［20］GENMANO J，KLEIN A S.Species-specific nuclear and chloroplast single nucleotide polymorphisms to distinguishPicea glauca，P.marianaand P.rubens［J］.Theor Appl Genet，1999，99：37-49.

［21］張婷，徐珞珊，王崢濤，等.藥用植物束花石斛、流蘇石斛及其形態(tài)相似種的PCR-RFLP鑒別研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（5）：728-733.

ZHANG Ting，XU Luoshan，WANG Zhengtao，et al.Molecular identification ofmedicinal plants：Dendrobium chrysanthum，Dendrobium fimbriatumand their morphologically allied species by PCR-RFLP analyses［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，40（5）：728-733.

［22］曹東偉，蔡宇良，楊娟，等.中國(guó)櫻桃的PCR-RFLP分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（5）：173-178.

CAODongwei，CAIYuliang，YANG Juan，etal.PCR-RFLP analysis ofPrunus pseudocerasus［J］.JNorthwest A& F Univ Nat Sci Ed，2007，35（5）：173-178.

Universal geneticmarkers for the Poaceae family

LIBingjuan,XIAO Guohui,XU Zaien,GUO Xiaoqin
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

To develop more universalmolecularmarkers for grasses,rich genetic information of bamboo plants and 14 pairs of primerswere designed according to the conserved regions of the single-copy orthologous（COSⅡ）genes of the Poaceae（grass）family.Then,polymerase chain reaction（PCR）was used to test five bamboo accessions.Also,Primer 1 and Primer 2 were used to sequence parts of the amplified products,and single nucleotide polymorphisms（SNP）sites were validated with the PCR-restriction fragment length polymorphism（RFLP）test.Based on different band styles amplified with the 14 primer pairs,genetic distance was calculated with NT sys 2.10e software and a cluster analysis of five species:Phyllostachys edulis,Ph.viridiglaucescens, Ph.nigra,Ph.violascens,andPh.vivaxf.aureocauliswere conducted.Results showed that all primers exhibited specific PCR products in at least one sample.Seven pairs of primers were able to amplify the products in tested sampleswith 13（92.9%）pairsofprimersexhibiting polymorphic PCR products in allsamples.Sequencing showed that Primer 1 and Primer 2 were homologous.These sequences were amplified with the same primer and existed at SNP sites.Some SNP sites led to early termination of the amino acid sequence,and some resulted in changes of restriction endonuclease sites.Results of the PCR-RFLP test corresponded with the sequencing.The cluster analysis indicated thatPh.edulisandPh.viridiglaucescenswere closely clustered,andPh.nigrawas the most isolated.Overall,this classification coincided with morphological classification;so,thesemolecular markers were suitable for application in genetic analyses and other related research withPhyllostachys.［Ch,4 fig.4 tab.22 ref.］

botany;Bambusoideae;transferabilitymolecularmarkers;single-copy orthologous genes;single nucleotide polymorphism（SNP）;PCR-RFLP

S718.46

A

2095-0756（2014）04-0508-07

2013-10-14；

2013-11-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30901155）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y307499）

李兵娟，從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：libingjuan313@163.com。通信作者：郭小勤，副教授，博士，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：xqguo@zafu.edu.cn