葉申怡，阮夏云，樊 瑩，張歡帥，井長怡，毛勝鳳，張愛蓮

(浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300)

美國山核桃Carya illinoensis，又名薄殼山核桃或長山核桃，原產(chǎn)于美國和墨西哥北部，世界多個國家都有引種栽培。中國江蘇省于20世紀(jì)引入栽培于淮安、南京、泰州、江陰等地。近年來，浙江農(nóng)林大學(xué)開展了薄殼山核桃引種、育種與推廣栽培。胡桃科Juglandacecae植物含有黃酮類、萜類、萘醌苷類、多酚類和有機(jī)酸類等成分，具有抑制醛糖還原酶，抑制細(xì)菌DNA起始復(fù)合物的形成，抗腫瘤，鎮(zhèn)痛消炎等作用[1－3]。胡旭姣等[5]的研究表明:山核桃葉片提取物具有抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)該腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。美國山核桃與山核桃Carya cathayensis同屬，兩者親緣關(guān)系相近。一般認(rèn)為，植物之間親緣關(guān)系相近的個體常具有類似的化學(xué)成分和相似臨床療效的規(guī)律。殷舒等[5]對山核桃葉片提取物的抑菌作用研究表明:山核桃葉片提取物對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus,大腸埃希菌Escherichia coli，酵母菌Saccharomyces cerevisiae，黃曲霉菌Aspergillus flavus，青霉菌Penicillium sp.和黑曲霉菌Aspergillus niger均有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法，首次對美國山核桃葉的總提取物，以及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水5個不同極性的提取物進(jìn)行抗菌作用研究，以期為今后農(nóng)業(yè)上的新型植物農(nóng)藥開發(fā)和醫(yī)學(xué)上的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料和供試菌種

美國山核桃葉，2012年10月采于浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)。菌種根霉菌Rhzopus oryzae，酵母菌Saccharomyces cerevisiae，黃曲霉菌Aspergillus flavus，青霉菌Penicillium sp.，大腸埃希菌Escherichia coli和枯草桿菌Bacillus subtilis均由浙江農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑與儀器

供試有機(jī)溶劑及所用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。使用下列儀器:SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南省予華儀器有限公司)；AB104-N分析天平；MLS-3750全自動蒸汽滅菌鍋(SANYO)；PRX-350C智能人工氣候箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)；MCV-B131FCT超凈工作臺(SANYO)。

2 方法

2.1 藥液的制備[5]

新鮮美國山核桃葉(5.00 kg)于50℃烘箱中烘48 h至干，粉碎，過40目篩，取粉500 g，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇回流提取3次，2 h°次－1，濾液合并，減壓濃縮至無醇味，烘干，得總浸膏72.6 g。取30.0 g總浸膏用水分散后分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取液及水相減壓濃縮回收溶劑，烘干，得到不同極性提取物。隨后用二甲基亞砜將總浸膏和不同提取物浸膏分別配制成質(zhì)量濃度為 10.000，5.000，2.500，1.250 和 0.625 g°L－1的藥液，備用。

2.2 菌種活化

將各供試細(xì)菌分別移接入牛肉膏斜面培養(yǎng)基上，真菌接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，真菌置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。

2.3 菌懸液的制備[6]

將活化好的各菌種制成比例為 1.0×108～1.0×109菌落形成單位(CFU)°L－1的菌懸液，備用。

2.4 抑菌試驗(yàn)-紙片法[7]

無菌條件下，取菌懸液0.1 mL，用無菌涂布棒均勻涂布在平板培養(yǎng)基上，將滅菌后直徑為6 mm的濾紙小圓片在上述各抽提液中浸泡20 min后，取出晾干，等距離貼于平板上，4片°皿－1，3個重復(fù)°菌種－1，分別以各自無浸膏的萃取液為空白對照。細(xì)菌置于31℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，真菌置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用十字交叉法，測定抑菌圈直徑，并按以下公式計算抑菌率:抑菌率=(對照菌落數(shù)－處理菌落數(shù))/對照菌落數(shù)×100%。

2.5 數(shù)據(jù)處理分析

2.5.1 抑菌直徑均值方差分析 抑菌圈直徑原始數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行多因素方差分析，并對平均數(shù)用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行多重比較。

2.5.2 真菌半數(shù)抑菌質(zhì)量濃度的計算[8]根據(jù)提取物質(zhì)量濃度與抑制率獲得回歸方程，計算各真菌抑制率在50%時的各提取物質(zhì)量濃度，即為各提取物對各真菌的半數(shù)抑菌質(zhì)量濃度(CE50)。

3 結(jié)果與分析

3.1 美國山核桃葉不同提取物的抑菌活性

美國山核桃葉各極性提取物對6株供試菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其中正丁醇提取物與乙酸乙酯提取物對除大腸埃希菌外的5株供試菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，故可認(rèn)為美國山核桃葉正丁醇提取物與乙酸乙酯提取物的抑菌效果最佳。而對于黃曲霉菌，石油醚提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性(表1)。

表1 美國山核桃葉各提取物對6株菌種抑菌圈的方差分析Table 1 Variance analysis of inhibition zone of different extracts from Carya illinoensis against 6 species of strains

由表1可知:美國山核桃葉不同極性提取物及總浸膏對細(xì)菌和真菌皆有抑菌作用，但各提取物的抑菌效果存在差異。對真菌的抑菌作用:石油醚提取物對黃曲霉菌的抑菌作用顯著大于其他4種提取物及總浸膏，在0.01及0.05水平上均存在顯著差異，故對于黃曲霉菌，石油醚提取物的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均值為8.35 mm；對于青霉菌，乙酸乙酯提取物的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均值為9.19 mm；對于酵母菌，正丁醇提取物的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均值為11.13 mm；對于根霉菌，乙酸乙酯提取物的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均值為10.86 mm。在對細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)中:正丁醇提取物對枯草桿菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均值為10.19 mm；而對于大腸埃希菌，水提取物的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑均值為9.13 mm。由此可知:美國山核桃葉的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均表現(xiàn)出較為廣譜的抑菌作用，對真菌與細(xì)菌都有不同程度的抑菌作用，且差異顯著；乙酸乙酯提取物對于根霉菌的抑菌作用顯著大于其他供試菌種，正丁醇提取物對于酵母菌和枯草桿菌的抑菌作用顯著大于其他供試菌種。故美國山核桃葉的正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌效果最佳。

3.2 美國山核桃葉不同濃度各極性提取物對各菌種的半數(shù)抑菌質(zhì)量濃度

由表2可知:美國山核桃葉的正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物對各真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用。對于酵母菌，正丁醇提取物表現(xiàn)出較其他提取物最強(qiáng)的抑菌活性，其半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(CE50)值為3.68 g°L－1。對于根霉菌，氯仿提取物表現(xiàn)出較乙酸乙酯提取物更強(qiáng)的抑菌活性，其CE50值為9.44 g°L－1。對于黃曲霉菌，石油醚提取物表現(xiàn)出較正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物更強(qiáng)的抑菌作用，CE50值為0.91 g°L－1。對于青霉菌，水提取物表現(xiàn)出較正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物更強(qiáng)的抑菌作用，CE50值為0.01 g°L－1。

表2 美國山核桃葉各提取物對6株菌種的半數(shù)抑菌質(zhì)量濃度Table 2 CE50of different extracts of Carya illinoensis against 6 species of strains

4 結(jié)論與討論

美國山核桃葉的各提取物中，正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物具有最佳抑菌效果。兩者均對革蘭氏陽性菌(枯草桿菌)具有明顯抑制作用，其中正丁醇提取物抑菌效果優(yōu)于乙酸乙酯提取物；正丁醇提取物對革蘭氏陰性菌(大腸埃希菌)抑制作用不明顯。各提取物對酵母型真菌和霉菌型真菌也有明顯抑菌作用，其中正丁醇提取物對酵母菌型真菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于乙酸乙酯提取物，而乙酸乙酯提取物對霉菌型真菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于正丁醇提取物。此外，石油醚提取物對黃曲霉菌具有最佳抑菌作用。由此推斷，美國山核桃葉所含抑菌成分復(fù)雜，可分布于不同有機(jī)相，且對不同的供試微生物有不同的抑菌效力。

張野平等[9]對胡桃醌對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用和抗菌作用研究表明，胡桃醌對許多革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用。潘亞琴等[10]對山核桃葉與美國山核桃葉中化學(xué)成分的初步分析研究表明，美國山核桃葉與山核桃葉中所含化學(xué)成分類型基本相同。由此可見，美國山核桃葉中也可能含有抑菌的有效成分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明美國山核桃葉提取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有明顯抑制作用。美國山核桃、山核桃和核桃楸(含有胡桃醌藥效成分)[11]為同屬植物,而胡桃醌對許多革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用[9，12]。利用植物親緣關(guān)系來尋找新的藥效成分的思路來分析，同屬的美國山核桃葉極可能含有類似的藥效成分。此外，美國山核桃葉還對新型隱球菌(酵母型真菌)和霉菌型真菌具明顯抗菌作用，對此種抗菌作用的有效成分有待于進(jìn)一步研究。

生物農(nóng)藥是天然存在的或者經(jīng)過基因修飾的藥劑，與常規(guī)農(nóng)藥的區(qū)別在于其獨(dú)特的作用方式、低使用劑量和靶標(biāo)種類的專一性。隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，生物農(nóng)藥的范疇不斷擴(kuò)大，涉及到動物、植物、微生物中的許多種類及多種與生物有關(guān)的具有農(nóng)藥功能的物質(zhì)。日益成長的有機(jī)農(nóng)業(yè)使得生物農(nóng)藥的需求逐漸上揚(yáng)，而美國山核桃在長江流域以南各省林儲豐富，從資源利用的角度可考慮在保護(hù)基礎(chǔ)上進(jìn)行合理開發(fā)。美國山核桃是落葉喬木，秋末冬初，葉會全部凋落，次年重新長出新葉，葉資源可不斷再生，因此，開發(fā)利用美國山核桃葉資源切實(shí)可行。

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