葉厚春

(贛縣人民醫(yī)院, 江西 贛州 341100)

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雙黃連注射劑中黃芩苷抗原合成及抗血清制備分析探討

葉厚春

(贛縣人民醫(yī)院, 江西 贛州 341100)

目的：對雙黃連注射劑中黃芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制備情況進(jìn)行分析探討，為今后藥物研究工作提供可靠的參考依據(jù)。方法：將黃芪苷與牛血清白蛋白采用高碘酸鈉法進(jìn)行交聯(lián)，鑒定方法為紫外掃描和SDS-PAGE法；經(jīng)黃芩苷與牛血清白蛋白復(fù)合物對新西蘭兔進(jìn)行免疫產(chǎn)生抗血清，采取ELISA法進(jìn)行檢測。結(jié)果：經(jīng)紫外掃描和SDS-PAGE法證實(shí)黃芩苷與牛血清白蛋白發(fā)生了交聯(lián)，ELISA法在新西蘭兔體內(nèi)檢測出黃芩苷與牛血清白蛋白復(fù)合物的抗血清，抗血清效價為1∶8 000。結(jié)論：經(jīng)高碘酸鈉法黃芩苷抗原合成成功，其為黃芩苷單克隆抗體的制備以及ELISA法快速檢測黃芩苷提供了可靠的依據(jù)，值得關(guān)注。

雙黃連注射劑；黃芩苷抗原；藥物合成；抗血清；鑒定

目前在臨床上中藥注射劑具有不可替代的作用，在疾病的治療中發(fā)揮重要的價值，減輕了患者的痛苦。然而注射劑不良反應(yīng)的存在也對其發(fā)展產(chǎn)生了一定的阻礙作用[1]。本次實(shí)驗(yàn)對雙黃連注射劑中黃芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制備情況進(jìn)行分析探討，分別采取高碘酸鈉法合成、紫外掃描和SDS-PAGE法進(jìn)行鑒定，并采取ELISA法對抗血清進(jìn)行檢測，具體情況報道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

AR1140/C型電子天平，TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，DE-1型磁力攪拌器，透析袋，高速冷凍離心機(jī)，CM-230超純水系統(tǒng)，VE-180型電泳槽，EPS300型電泳儀，TY-80A型脫色搖床，THA-3560C高壓滅菌鍋，核酸蛋白分析儀，微量移液器，BIO-TEKELX-800酶標(biāo)儀，DZF-6050型恒溫干燥箱，MA110型電子天平，超聲波清洗器，可調(diào)電爐，無菌注射器，酶標(biāo)板，封口膜。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

本次實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動物為健康新西蘭大白兔；試劑包括：黃芩苷單體，蒸餾水，牛血清蛋白，DMF(分析純)，高碘酸鈉，乙二醇(分析純)，吡啶，二乙基氨基乙基纖維素，生理鹽水，β-巰基乙醇， Tris丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺， 過硫酸銨(AP)(分析純)，十二烷基磺酸鈉(SDS)(分析純)，甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)，戊二醛50%(分析純)，甘油(分析純)，硝酸銀(分析純)，檸檬酸(分析純)，甲醛溶液、冰醋酸(分析純)，氨水，甲醇、無水乙醇(分析純)。

2 方法

2.1 抗原合成

精取黃芩苷單體22.3mg，經(jīng)吡啶溶解，精稱高碘酸鈉10.7mg，加1mL蒸餾水溶解，將其加入到黃芩苷溶液中，室溫下攪拌20min,加入1mL分析純乙二醇，室溫?cái)嚢?min，稱取牛血清白蛋白16.25mg，加2mL磷酸緩沖溶液，將牛血清白蛋白溶液加入到上述黃芩苷反應(yīng)液中，4℃條件下靜置過夜，加新配制的NaHB41mL,室溫條件下反應(yīng)3h，然后在反應(yīng)液中加入磷酸緩沖溶液透析，每6h換一次液，連續(xù)透析2天，透析結(jié)束后離心分離，取濾液經(jīng)冷凍干燥最終獲得黃色固體粉末[2]。

2.2 抗血清制備

取三只健康雄性新西蘭大白兔，兩只采取上述制備的黃芩苷抗原進(jìn)行免疫，另外1只注射生理鹽水進(jìn)行對照。黃芩苷抗原注射流程為：取黃芩苷抗原溶液2mL，加入等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化后基礎(chǔ)免疫，在兔背部進(jìn)行多點(diǎn)注射，每只兔子注射劑量為2mL，20天后間斷性加強(qiáng)免疫，劑量與基礎(chǔ)劑量相同，在4次免疫結(jié)束后采集兔子耳緣靜脈血，4℃條件下保存[3]。

2.3 抗血清分離

精取上述所得血清20mL,加20mL生理鹽水進(jìn)行溶解，再逐滴加入10mL(NH4)SO4飽和溶液,邊加邊攪拌，混勻后靜置30min，在3 000r/min條件下離心20min,取沉淀，加20mL生理鹽水，再次加入10mL(NH4)SO4飽和溶液，混勻后靜置30min，在3 000r/min條件下離心20min,棄上清，去除白蛋白，上述步驟重復(fù)2～3次。用10mL生理鹽水將沉淀溶解，裝入透析袋中，透析除鹽，過夜，4℃條件下透析24h，采取氯化鋇對透析液中硫酸根離子進(jìn)行檢查，在確保無硫酸根離子和NH4存在時進(jìn)行離心操作，將沉淀去除，所得上清液即為抗血清。

3 結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)中采取紫外掃描儀和SDS-PAGE法對黃芩苷與載體蛋白的偶聯(lián)成功與否進(jìn)行了檢查，于190～400nm下對其吸收值進(jìn)行測定，以反應(yīng)前后紫外吸收光譜改變情況對偶聯(lián)與否進(jìn)行判斷，如圖1所示，經(jīng)分析，黃芩苷分別于215nm、247nm、279nm及 315nm處均有吸收峰，牛血清蛋白于278nm處出現(xiàn)最大吸收峰，而黃芩苷牛血清蛋白偶聯(lián)物于271nm出現(xiàn)最大吸收峰，相較于載體蛋白牛血清，偶聯(lián)無最大吸收峰出現(xiàn)偏移，證實(shí)偶聯(lián)成功；而后采取間接ELISA法對抗血清進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在新西蘭兔體內(nèi)檢測出黃芩苷與牛血清白蛋白復(fù)合物的抗血清，將抗血清吸光度為陰性血清吸光度2倍時，抗血清最大稀釋倍數(shù)為抗血清效價，通過對反應(yīng)液于波長為450nm處吸光度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)抗體效價是1∶8 000，具體見表1。

圖1 牛血清蛋白、黃芩苷牛血清蛋白偶合物及黃芩苷紫外吸收曲線

稀釋倍數(shù)1∶10001∶20001∶40001∶80001∶160001∶32000陰性對照A450吸光度1.4751.2070.7580.3040.0880.0300.102

4 討論

目前臨床中藥注射劑應(yīng)用中不良反應(yīng)的發(fā)生受到了廣大醫(yī)學(xué)工作者和患者的關(guān)注。雙黃連注射劑中黃芩苷所誘發(fā)的過敏反應(yīng)一般為Ⅰ型超敏反應(yīng)，主要抗體為IgE[4]。本實(shí)驗(yàn)中成功合成了黃芩苷抗原，并在新西蘭大白兔中成功免疫獲得抗血清IgG，對今后雙黃連注射液制劑中致敏原IgE的發(fā)現(xiàn)提供了可靠的依據(jù)。

[1] 丁玉峰.中藥注射劑引起的變態(tài)反應(yīng)及其影響因素[J].華中醫(yī)學(xué)雜志,2007,31(4):244-246．

[2] 李東,方世平.注射用雙黃連不良反應(yīng)的流行病學(xué)特點(diǎn)及對策[J].中國藥業(yè),2000,9(9):19-20．

[3] 賴宇紅,陳浩桉,楊衛(wèi)榮.中藥注射劑變態(tài)反應(yīng)研究亟待加強(qiáng)[J].中藥新藥與臨床藥理,2002,13(5):324-325．

[4] 楊曉慶,姚海,黃益民,等.魚腥草注射液致過敏反應(yīng)120例文獻(xiàn)分析[J].藥物不良反應(yīng)雜志,2005(6):421-423．

(責(zé)任編輯：魏 曉)

2014-04-01

葉厚春(1973-)，男，江西省贛州市贛縣人民醫(yī)院主管藥師，研究方向?yàn)榕R床藥理。

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1673-2197(2014)21-0012-02