祁麗婷 李中青 趙晉峰 李齊霞 李顏芳 王瑞 孫萬榮 王敏 王楓葉

摘要 [目的] 明確山西主要玉米品系的主要遺傳多樣性特點。 [方法]利用ISSR分子標記技術，對供試的玉米種質資源進行遺傳多樣性分析。[結果]用篩選出的9個多態(tài)性高、重復性好的引物對供試種質材料進行擴增，共擴增出清晰條帶74條，多態(tài)性條帶56條，多態(tài)性條帶比率為75.7%。應用DPS軟件對試驗結果進行聚類分析，構建聚類分析樹狀圖，在遺傳相似系數(shù)為0.55處，將供試種質材料分為5個類群。[結論] 為今后山西玉米育種與雜交親本的選擇提供理論依據(jù)。

關鍵詞 ISSR;玉米;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12046-02

Genetic Diversity of Maize Accessions Using Intersimple Sequence Repeat （ISSR） Markers

QI Liting，LI Zhongqing， ZHAO Jinfeng et al

（Millet Research Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Changzhi， Shanxi 046011）

Abstract [Objective] The aim was to clear main genetic diversity characteristics of main corn strain ?in Shanxi. [Method]Using ISSR molecular markers to analyze the genetic diversity of maize germplasm resources. [Result] Nine primer of high polymorphism and good repeatability were used to amplify the germplasm material on the test. 74 bands were amplified， including 56 polymorphism bands. The percentage of polymorphism bands was 75.7%. Application of DPS software clustering analysis was carried out on the experimental results， and built the cluster analysis tree. The test germplasm materials were divided into five groups at the genetic similarity coefficient of 0.55. [Conclusion] The study provided theoretical reference for the selection of hybrid parent and maize breeding in the future.

Key words ISSR;Maize;Genetic diversity;Cluster analysis

玉米是現(xiàn)代食品、飼料、醫(yī)藥及化工的重要原料作物，在國民經濟中占有非常重要的地位。山西省玉米種植面積達160萬hm2，已取代小麥成為山西省的第一大糧食作物。生態(tài)適應性分析表明，玉米是山西最適宜種植的作物，在山西具有明顯的區(qū)域優(yōu)勢。近年來，由于分子生物學的飛速發(fā)展，不僅可以在分子水平上了解育種材料的遺傳變異信息，有針對性地選擇雜交親本，在后代中獲得優(yōu)良變異，從而培育出優(yōu)良品種，同時了解這些品種的遺傳多樣性，對于指導親本選配和培育優(yōu)質高產品種具有重要意義。

筆者擬采用最為廣泛應用的ISSR分子標記技術[1]，對山西生產區(qū)域內主要自交系進行遺傳多樣性分析，明確山西主要玉米品系的主要遺傳多樣性特點，為今后山西玉米育種與雜交親本的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料均由山西省農科院谷子研究所早熟課題組提供（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米總DNA提取。 將供試材料播種在裝有沙子的營養(yǎng)缽中，在溫室（25 ℃左右）內培養(yǎng)。每個材料種10株左右，待幼苗長至3～4葉，葉片長度為10 cm左右時剪去葉片，采用通用的CTAB方法提取總DNA，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 反應程序。

①反應體系（20 μl）：2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μl，10×buffer 2.0 μl，2 μmol/L 引物2 μl，5 U/μl Taq酶 0.2 μl，DNA 模板 3.0 μl，ddH2O 11.2 μl，另加mineral oil密封，在PCR板中進行。

②PCR 反應程序：94 ℃變性7 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45 個循環(huán);72 ℃后延伸7 min，4 ℃保存。

③電泳檢測：擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。 PCR產物中加入 6×loading buffer 4 μl，混勻后點樣于孔中，接通電源后，電泳儀電壓調至120 V進行電泳。

④電泳結束后，將電泳結果在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照相、保存。

表1 供試試驗材料

編號自交系名稱編號自交系名稱編號自交系名稱

1C19015C20629Mo17

2C19116C20930鄭58

3C19217C21231H51

4C19318C21332H391

5C19419C21433先玉128M

6C19520C21634冀海57

7C19621C21735478

8C19822C21936M2

9C19923C22137K12

10C20024C22038先玉508M

11C20225C22239先父

12C20326C223409903

13C20427C224

14C20528昌7-2

1.3 ?數(shù)據(jù)處理與分析

人工讀取條帶，采用1/0記錄方式。相同遷移率位置上有條帶的記為1，無條帶的記為0，建立數(shù)據(jù)矩陣。用DPS 6.05分析軟件中UPGMA對其進行聚類分析并繪制親緣關系樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增多態(tài)性

從52對引物中篩選出9條條帶清晰、穩(wěn)定且無拖尾的引物（表2）。用篩選出的引物對供試自交系材料進行擴增（圖1、2），共擴增出清晰條帶74條，多態(tài)性條帶56條，多態(tài)性條帶比率為75.7%，表明供試自交系材料擴增出的片段具有較高的多態(tài)性。

表2 ISSR引物序列及其擴增產物的多態(tài)性比較

引物名稱引物序列總帶數(shù)多態(tài)條帶多態(tài)性比例∥%

ISSR 8075′AGAGAGAGAGAGAGAGT3′9.07.077.78

ISSR 8085′AGAGAGAGAGAGAGAGC3′8.06.075.00

ISSR 8105′GAGAGAGAGAGAGAGAT3′10.09.090.00

ISSR 8115′GAGAGAGAGAGAGAGAC3′10.08.080.00

ISSR 8155′CTCTCTCTCTCTCTCTG3′7.04.057.14

ISSR 8175′CACACACACACACACAA3′8.06.075.00

ISSR 8185′CACACACACACACACAG3′7.05.071.43

DISSR 8255′ACACACACACACACACT3′9.05.055.56

ISSR 8275′ACACACACACACACACG3′8.06.075.00

ISSR 8645′ATGATGATGATGATGATG3′7.05.071.43

總數(shù)83.061.0

平均8.36.172.83

圖1 ?P811對部分玉米自交系ISSR的擴增圖譜

2.2 聚類分析

將構建好的ISSR數(shù)據(jù)輸入DPS 6.50中，應用類平均法（UPGMA）獲得聚類圖（圖3）。在遺傳相似系數(shù)為0.55處，40份玉米自交系可以分為5個類群。第Ⅰ類包括C190、C192、C200、C191、C193、C194、H391、C203、C205、昌72、9903共11個株系;第Ⅱ類包括C195、C204、鄭58、478、C206、C209、C213、C214、C216、C217、M2、先玉508M、先玉128M、C196、C198、Mo17、H51、先父、K12共19個株系;第Ⅲ類包括C212、C222、C223、C224、C219、C221、C220共7個株系;第Ⅳ類包括C199一個株系;第Ⅵ類包括C202、冀海57 2個株系。

圖2 P864對部分玉米自交系ISSR的擴增圖譜

圖3 玉米自交系的ISSR親緣關系聚類圖譜

3 討論

分子生物學的發(fā)展使得種質資源之間的遺傳性以及親緣關系得到了明確。特別是ISSR標記技術，憑借其較好的穩(wěn)定性、試驗的可重復性以及操作簡單、快速、高效等優(yōu)點[2-4]，廣泛應用于基因定位、品種鑒定、遺傳作圖、系統(tǒng)發(fā)育[5]、進化及分子生態(tài)學等研究中，特別是應用于遺傳多樣性和親緣關系研究中[6-7]。

從該試驗看，ISSR分子標記是一種較為理想的標記方法，在一定程度上可以確定各個種質材料之間的遺傳關系。但由于目前的種質材料繁多，特別是經過多年的種植和應用，難免會有基因漂移、突變等因素，所以筆者只能確定該試驗材料之間的親緣關系。該試驗卻與公認的類群分類有出入。如鄭58屬于瑞種質，Mo17屬于蘭卡斯特種質，卻被分在了同一個類群。這也與王寒玉等得出的試驗結論相同[8-9]。另外，讀取條帶時為人工讀帶，可能會存在不同的人讀取的條帶會有所差異，以及聚類分析軟件的不相同，這也是試驗結果可能不一致的原因。所以劃分的種群是相對的。

4 結論

該研究表明，利用ISSR分子標記技術對玉米進行遺傳多樣性分析是可行的。但此方面研究還應與實際育種工作相結合，使得育種工作者可以充分了解材料的育種變異信息，有針對性地選擇親本，有效提高育種效率[10]，培育優(yōu)質的新品種，才能更好地為育種工作提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20（2）：176-183.

[2] 方宣均，吳為人，唐紀良.作物 DNA 標記輔助育種[M].北京：科學出版社，2001.

[3] 李洪偉，沙偉.ISSR 技術及其在玉米研究中的應用[J].齊齊哈爾大學學報，2007，7（4）：88-90.

[4] 羅海燕，陳業(yè)淵.ISSR分子標記及其應用[J].安徽農學通報，2008，14（19）：45-46.

[5] 陳龍， 王家良， 楊賢松.ISSR分子標記及其在植物分子生物學中的應用[J].種子，2007，10（26）：49-52.

[6] 錢韋，葛頌，洪德元.采用RAPD和ISSR標記探討中國疣粒野生稻的遺傳多樣性[J].植物學報，2000，42（7）：741-750.

[7] 馬朝芝，傅廷棟，STINE TUEVESSON，等.用ISSR標記技術分析中國和瑞典甘藍型油菜的遺傳多樣性[J].中國農業(yè)科學，2003，36（11）：1403-1408.

[8] 王寒玉，杜艷偉，李萍，等.40份玉米自交系的 ISSR 遺傳多樣性分析[J].山西農業(yè)科學，2010，38（7）：11-15.

[9] 程春明，石云素，宋燕春，等.ISSR分子標記技術在分析玉米自交系遺傳關系研究中的適用性[J].植物遺傳資源學報，2005，6（2）：172-177.

[10] 趙欣欣，崔克艷，劉光濤，等.玉米自交系的ISSR聚類分析[J].吉林農業(yè)大學學報，2009，31（2）：131-134.