王友利 楊海波 于媛

摘要

[目的] 確定硝酸鈉濃度對亞心形扁藻生長及油脂和淀粉含量的影響。[方法] 以亞心形扁藻作為試驗材料，以海洋微藻培養(yǎng)常用的普適性康維方營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，考察硝酸鈉質(zhì)量濃度為10 mg/L、60 mg/L、110 mg/L、160 mg/L和210 mg/L的培養(yǎng)基對亞心形扁藻生長及油脂和淀粉含量的影響。[結(jié)果] 當(dāng)硝酸鈉濃度為10 mg/L時，有利于油脂、淀粉的合成，但此時扁藻生長慢，生物量低，使得這些生物組分的總產(chǎn)量低;當(dāng)硝酸鈉質(zhì)量濃度為60 mg/L時，油脂和淀粉含量較高，并且扁藻生長快，油脂、淀粉的總產(chǎn)量高;繼續(xù)增加硝酸鈉濃度時，扁藻生物量和各組分含量基本不變。[結(jié)論] 從微藻生物能源角度考慮，60 mg/L的硝酸鈉質(zhì)量濃度是培養(yǎng)亞心形扁藻的優(yōu)化濃度。

關(guān)鍵詞 亞心形扁藻;硝酸鈉;油脂;淀粉;生物量

中圖分類號 S968.49 ?文獻標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12247-03

Effects of Sodium Nitrate Concentration on the Growth of Platymonas subcordiformis and the Contents of Oil and Starch

WANG Youli， YANG Haibo*， YU Yuan

（Department of Environmental and Chemical Engineering， Dalian University， Dalian， Liaoning 116622）

Abstract [Objective]] To confirm the effects of sodium nitrate concentration on the growth of Platymonas subcordiformis and on the contents of oil and starch in it. [Method] Based on the conventional Kangwei nutrient medium used in culturing marine microalgae， the concentration of sodium nitrate from 10 to 210 mg/L in an interval of 50 mg/L were investigated in increasig the biomass of P. subcordiformis and the contents of oil and starch. [Result] 10 mg/L sodium nitrate was suitable for synthesizing of oil and starch in P. subcordiformis， while P. subcordiformis grew slowly at the concentration because of the lack of nitrogen nutrient. And 60 mg/L sodium nitrate was advantageous to both the biomass of P. subcordiformis and the contents of oil and starch. When the concentration of sodium nitrate was gradually increased， the biomass and the contents changed a few. [Conclusion] From the view of microalgae bioenergy， 60 mg/L sodium nitrate is suitable for culturing P. subcordiformis and extracting oil and starch in it.

Key words ?Platymonas subcordiformis; Sodium nitrate; Oil; Starch; Biomass

作者簡介

王友利（1988-），男，山東日照人，碩士研究生，研究方向：海洋微藻生物能源。*通訊作者，教授，從事海洋微藻生物能源研究。

收稿日期 20141027

亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）不僅是水產(chǎn)動物育苗過程中常用的優(yōu)質(zhì)餌料，而且因其油脂和淀粉含量高，近些年，逐漸受到微藻生物能源領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注[1-2]。

氮是構(gòu)成海洋微藻生物體的重要元素之一，是微藻生命活動的必需物質(zhì)，但不同氮源對微藻生長及其細胞內(nèi)生物組分的合成有著不同影響。劉懷平等[3]的研究表明，在添加NaNO3時，網(wǎng)狀空星藻（Coelastrum reticulatum）及柵藻（Scenedesums sp.）的單位體積總脂含量達到最高。Fan等[4]的研究發(fā)現(xiàn)以尿素和銨為氮源時，微型原甲藻（Prorocentrum minimum）生長速率增加。王帥等[5]研究表明，氮濃度對小球藻（Chlorella）和微綠球藻（Nannochloropsis）的非光化學(xué)猝滅（NPQ）和光化學(xué)猝滅（qP）影響顯著。在低氮條件下，兩種藻的熒光參數(shù)Fv/Fm、產(chǎn)量和NPQ均有明顯下降，細胞濃度、葉綠素相對含量也均有不同程度的降低。孟迎迎等[6]的研究表明，氮元素顯著影響扁藻生長、產(chǎn)物組成及其含量，尿素氮促進扁藻的生長，并有利于蛋白質(zhì)積累，銨態(tài)氮則利于淀粉的積累。

鑒于亞心形扁藻在生物能源方面的應(yīng)用潛力，該研究以海洋微藻培養(yǎng)常用的普適性康維方營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，研究硝酸鈉質(zhì)量濃度分別為10 mg/L、60 mg/L、110 mg/L、160 mg/L和210 mg/L的康維方營養(yǎng)液對亞心形扁藻生長及油脂、淀粉含量的影響，為該微藻在生物能源方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)試驗依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 ?試驗藻種

試驗所用亞心形扁藻藻種為筆者試驗室收藏保存的藻種。

1.2 試驗方法及培養(yǎng)條件

以海洋微藻培養(yǎng)常用的普適性康維方營養(yǎng)液[7]為基礎(chǔ)，培養(yǎng)液中其他營養(yǎng)成分不變，改變硝酸鈉濃度，使最終培養(yǎng)液中的濃度分別為：10 mg/L、60 mg/L、110 mg/L、160 mg/L和210 mg/L。試驗所用其他試劑均為分析純。

取500 ml處在對數(shù)生長期的藻液，接種到含3 L滅菌海水的5 L錐形瓶中。每組濃度設(shè)兩個平行樣，在溫度25 ℃，光照強度1 800 lx，光照周期12 h∶12 h的條件下進行培養(yǎng)。每天早、晚各搖瓶一次，以促進瓶內(nèi)培養(yǎng)液內(nèi)部的物質(zhì)交換。每隔24 h測定一次生物量，繪制扁藻生長曲線;每隔48 h取一次樣，測定扁藻細胞內(nèi)油脂和淀粉的含量。根據(jù)不同硝酸鈉濃度下扁藻生物量及細胞內(nèi)油脂和淀粉含量隨培養(yǎng)時間的變化關(guān)系確定優(yōu)化硝酸鈉濃度。

1.3 測定方法

1.3.1

生物量測定。藻生物量由分光光度法測定。取10 ml混勻的藻液，測定其在680 nm波長下的吸光度。

1.3.2

藻泥分離及處理。每次取300 ml混勻的扁藻培養(yǎng)液，在3 500 r/min下離心5 min，將藻泥均分到2個5 ml離心管內(nèi)（編號分別為Ⅰ和Ⅱ），用去離子水洗滌藻泥2次，均在6 000 r/min下離心5 min，收獲藻泥并稱重后，反復(fù)凍融破碎細胞6次，備用。編號Ⅰ中的藻泥用于測淀粉含量，編號Ⅱ中的藻泥用于測油脂含量。

1.3.3

油脂含量的測定。油脂含量采用氯仿-甲醇法[8]測定。取“1.3.2”中編號為Ⅱ的藻泥，加入氯仿-甲醇萃取劑萃取，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干萃取劑后，稱量剩余油脂質(zhì)量，油脂含量的計算公式為：

油脂含量=m/M×100%

式中，m為油脂質(zhì)量（mg）;M為藻泥質(zhì)量濕重（mg）。

1.3.4

淀粉含量的測定。采用徐嬪等[9]的方法，將樣品用乙醇、石油醚洗滌脫色和除脂后，加入過氧化氫脫去樣品底色，再以80%的硝酸鈣溶液作為淀粉提取劑，碘作顯色劑，于570 nm處測定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中淀粉含量，淀粉含量計算公式為：

淀粉含量=ρstvst×25×100%/（4×M1）

式中，ρst為淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（0.1 mg/ml）;

vst為樣品吸光度所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）;

M1為藻泥質(zhì)量濕重（mg）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線以0.1 mg/ml淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制，所得方程為：y=0.409 5x+0.006 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，其中y為570 nm處的吸光度值，x為淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鈉濃度對扁藻生物量的影響

氮作為生物生長的重要營養(yǎng)元素，除影響扁藻的生物量外，還對扁藻生物組分的合成產(chǎn)生重要影響，其濃度高低對微藻生長及其生物組成起至關(guān)重要的作用[10]。圖1是不同硝酸鈉濃度下亞心形扁藻生物量隨培養(yǎng)時間的變化關(guān)系。

由圖1中可以看出，當(dāng)硝酸鈉濃度為10 mg/L時，扁藻生物量明顯低于其他濃度時的生物量，并且隨培養(yǎng)時間延長，生物量基本不增加，說明氮濃度低時不利于該扁藻的生長。當(dāng)硝酸鈉濃度從60 mg/L上升至210 mg/L時，扁藻生物量幾乎呈直線上升，說明在這些濃度下扁藻能夠快速地進入對數(shù)生長期，至培養(yǎng)20 d時基本進入平衡期，生物量增至最高。由圖1還可見，硝酸鈉濃度為60 mg/L時的扁藻生物量與其他3種高硝酸鈉濃度時的生物量在培養(yǎng)的前15 d幾乎相等，只是在培養(yǎng)至20 d后才略微低于后者，說明扁藻對硝酸鈉的需求有合適的濃度，一味增加其濃度，并不能有效提高扁藻生物量。圖1結(jié)果表明濃度60 mg/L的硝酸鈉對扁藻生長是有利的。

圖1 不同濃度硝酸鈉對亞心形扁藻生長的影響

2.2 硝酸鈉濃度對扁藻細胞內(nèi)油脂含量的影響

單位體積油脂產(chǎn)量是衡量微藻生物能源化潛力的指標(biāo)之一，它與微藻的生物量和油脂含量均有關(guān)[11]。圖2顯示了不同硝酸鈉濃度下扁藻油脂含量隨培養(yǎng)時間的變化趨勢。

圖2 不同濃度硝酸鈉對亞心形扁藻油脂含量的影響

由圖2可見，當(dāng)硝酸鈉濃度為10 mg/L時，亞心形扁藻細胞內(nèi)的油脂含量明顯高于其他濃度時的含量。隨著氮濃度升高，油脂含量隨之下降，當(dāng)濃度達到110 mg/L時，油脂含量達到最低，之后油脂含量隨著氮濃度的增加而略有增加，但變化不大。當(dāng)硝酸鈉濃度為60 mg/L時，油脂含量僅次于硝酸鈉濃度為10 mg/L時的含量，結(jié)合圖1中的扁藻生物量變化趨勢可見，為獲得較高的油脂產(chǎn)量，選擇硝酸鈉濃度為60 mg/L是比較有利的。由圖2還可見，在扁藻培養(yǎng)初期油脂含量較高，隨著培養(yǎng)時間的延長，油脂含量緩慢下降。因此，為獲得較高的油脂產(chǎn)量，在扁藻的快速生長期收集藻泥較好。孫育平等[12]的研究表明，亞心形扁藻在低氮、低磷條件下比高氮、高磷條件下生長得好，當(dāng)?shù)|(zhì)量濃度為80 mg/L，磷質(zhì)量濃度為8 mg/L時，亞心形扁藻相對生長指數(shù)和平均生長率最大。該研究結(jié)果與其基本一致。而姜永和等[13]的研究認為，含50 mg/L硝酸鈉的培養(yǎng)液適合于扁藻生長和油脂合成。

Lee等[1]的研究表明，在非限制或高氮濃度下，微藻體內(nèi)蛋白質(zhì)等大量合成，可以得到總生物量或某種成分的最大生成量，雖然油脂的合成量有所增加，但不會得到較高的油脂含量。最適氮質(zhì)量濃度上的微小差別，可能是與試驗前的濃度設(shè)置有關(guān)。綜合這些研究結(jié)果可見，硝酸鈉濃度在50～80 mg/L范圍內(nèi)時比較有利于扁藻生長及油脂合成。

圖3 不同濃度硝酸鈉對亞心形扁藻淀粉含量的影響

2.3 硝酸鈉濃度對扁藻細胞內(nèi)淀粉含量的影響

淀粉是綠色微藻細胞光合作用的產(chǎn)物，其經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇可以用作生物燃料。淀粉含量的多少也可以作為衡量微藻生物能源化的一項指標(biāo)。圖3顯示了不同硝酸鈉濃度對亞心形扁藻細胞內(nèi)淀粉含量的影響。

由圖3可見，隨著硝酸鈉濃度增加，亞心形扁藻細胞內(nèi)的淀粉含量逐漸降低，這是因為在營養(yǎng)鹽充足的情況下，微藻細胞生長旺盛，細胞器大量增殖為繁殖做準(zhǔn)備，而不會大量合成儲能物質(zhì)占據(jù)胞內(nèi)空間，細胞自主將胞內(nèi)糖類外運，從而導(dǎo)致了細胞體內(nèi)淀粉含量的下降。雖然硝酸鈉質(zhì)量濃度為10 mg/L時的淀粉含量最高，但同樣因為此時扁藻生物量低的原因，導(dǎo)致無法獲得較高的淀粉產(chǎn)量。Giuliano等[14]研究了營養(yǎng)限制對微藻淀粉積累的影響，其結(jié)果表明當(dāng)?shù)春谋M時，微藻細胞的生長速度明顯慢于氮源充足時的速度，但有利于微藻細胞內(nèi)淀粉的積累。該試驗結(jié)果同樣說明了這一點。

3 結(jié)論

氮是微藻生長必需的重要營養(yǎng)元素之一，其濃度直接影響微藻的生長及其組分的合成。該試驗以可做生物能源潛在資源的亞心形扁藻為試驗對象，研究了不同硝酸鈉濃度對亞心形扁藻生長及細胞內(nèi)油脂和淀粉含量的影響。結(jié)果表明，為獲得較高的油脂和淀粉含量，硝酸鈉濃度可控制在50～80 mg/L范圍內(nèi)，并且應(yīng)在培養(yǎng)的快速生長期收獲藻泥。

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