袁斌 張舒 呂亮

摘要

[目的]構(gòu)建抗南方水稻黑條矮縮病毒（Southern Rice Black-Streaked Dwarf Virus）的RNA干涉載體。[方法]通過PCR擴(kuò)增、克隆并測(cè)序獲得SBRSDV病毒S9基因的703 bp片段，與其他地方分離物S9序列的同源性高達(dá)99%，將此片段連接至pDS1301上，并對(duì)陽性克隆進(jìn)行菌落PCR、酶切等驗(yàn)證。 [結(jié)果]成功構(gòu)建了可以用于轉(zhuǎn)化水稻產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株的抗SBRSDV病毒的RNAi載體。[結(jié)論]利用SBRSDV病毒S9基因的部分片段構(gòu)建了pDS1301S9 RNA雙鏈干涉載體，為創(chuàng)建水稻抗SBRSDV新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 南方水稻黑條矮縮病;RT-PCR;外殼蛋白;RNAi

中圖分類號(hào) S511 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12048-03

Construction of RNA Silencing Expression Vectors for S9 of Southern Rice Black-Streaked Dwarf Virus

YUAN Bin1，2，3， ZHANG Shu1，2，3， LV Liang1，2，3

（1. Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064; 2. Key Laboratory of Integrated Management of Crops of Central China， Ministry of Agriculture， Wuhan， Hubei 430064; 3. Hubei Key Laboratory of Crop Disease， Insect Pests and Weeds Control， Wuhan， Hubei 430064）

Abstract [Objective] Construction of RNA silencing expression vectors resistant to Southern Rice BlackStreaked Dwarf Virus. [Method] A 703bp fragment of S9 gene of SRBSDV was produced through PCR amplification， cloned and sequenced. The results show that the S9 gene identity is as high as 99%. The fragment was cloned into RNAi vector pDS1301. The positive clones were detected by PCR， enzyme digestion. [Result] The experimental results showed that RNAi vector resistant to SRBSDV was constructed successful. [Conclusion] The vector of pDS1301S9 by using part of the S9 gene fragments was constructed for SBRSDV virus， the result laid a foundation for creating the rice new germplasm of resistance to SBRSDV.

Key words Southern Rice BlackStreaked Dwarf Virus; RTPCR; Coat protein; RNAi

基金項(xiàng)目 湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011CDB118）;十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2012BAD19B03）;湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新中心項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介

袁斌（1970-），男，江西宜春人，副研究員，博士，從事分子植物病理學(xué)研究。

收稿日期 20141023

2001年廣東陽西縣首次發(fā)現(xiàn)一種新的水稻病毒病，將其命名為南方水稻黑條矮縮?。⊿RBSDV）[1]。該病嚴(yán)重危害水稻，還可危害其他禾本科作物;發(fā)展速度快;病毒由遷飛性害蟲白背飛虱為主要傳毒媒介，且傳毒效率非常高。SRBSDV迅速上升成為湖北省水稻生產(chǎn)的主要病害之一。

目前，利用抗（耐）病毒病和介體的品種是防治植物病毒最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便而有效的措施，但抗?。ㄏx）的抗源較少。生物工程技術(shù)在創(chuàng)建抗病毒材料上起著重要作用。自1986年首次將煙草花葉病毒（Tabacco Mosaic Virus， TMV）的CP基因轉(zhuǎn)入煙草以來[2]，馬鈴薯X病毒（Potato Virus X， PVX）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus， CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y， PVY）等多種病毒的CP蛋白被轉(zhuǎn)移進(jìn)入相應(yīng)的植物體中產(chǎn)生新的抗病種質(zhì)。還有利用病毒復(fù)制酶和運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement Protein，MP）基因介導(dǎo)的抗病性[3-6]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，以病毒基因組序列為靶位點(diǎn)來進(jìn)行RNAi，抑制病毒的復(fù)制與表達(dá)以達(dá)到抗病毒病的目的手段出現(xiàn)，抗病效果表現(xiàn)得更為高效。這種由dsRNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing， PTGS），在植物抗病毒的研究中具有廣闊的前景。目前，我國(guó)還沒有鑒定出抗該病的水稻品種，也未見有RNAi創(chuàng)建出抗病新種質(zhì)的報(bào)道。筆者使用在水稻成熟使用的雙元載體pDS1301構(gòu)建SRBSDV病毒沉默載體，以期通過轉(zhuǎn)基因的方式創(chuàng)建水稻抗SRBSDV新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試材料。2010年從武漢、鄂州、崇陽等地采集水稻疑似病株進(jìn)行檢測(cè)。湖北崇陽發(fā)病田塊的水稻病株用于克隆SRBSDV病毒的S9基因片段。

1.1.2

試劑與載體。pGEMGZ載體是利用pGEMT改造，在BamH I的外側(cè)添加有Sac I位點(diǎn)，Kpn I的外側(cè)添加有Spe I位點(diǎn)，以方便擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和雙鏈RNAi載體的構(gòu)建。Taq DNA合成酶、dNTP和限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司;質(zhì)粒抽提和膠回收試劑盒也購自TaKaRa公司;PCR引物由Invitrogen公司合成。用于構(gòu)建RNA干涉的載體pDS1301來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[7]。

1.2 方法

1.2.1

湖北省水稻SRBSDV疑似病株的檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)提供的檢測(cè)SRBSDV和RBSDV的特異引物序列合成引物[8-9]，采用RTPCR技術(shù)檢測(cè)，SRBSDV的特異引物對(duì)為S10F和S10R，RBSDV的特異引物對(duì)為RS10F和RS10R（表1）。利用湖北省各地水稻疑似病株抽提總RNA，用隨機(jī)引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，分別以S10F和S10R、RS10F和RS10R為引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)樣品的病原物。PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液 2 ?μl，2.5 mmol的混合dNTP 2 μl，25 mmol的MgCl2 2 μl，Taq DNA 聚合酶0.2 μl，10 μmol/L上游引物0.5 μl， 10 ?μmol/lL下游引物0.5 ?μl，模板0.5 ?μl，加ddH2O 至20 ?μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.2

SRBSDV病毒S9片段的獲取。利用S9iF和S9iR引物對(duì)擴(kuò)增S9基因的片段（表1）。采用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增得到SRBSDV病毒CP和S9基因的各個(gè)片段。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物挖膠回收，克隆到pGEMGZ載體上，送公司測(cè)序驗(yàn)證。將獲得的S9基因片段陽性克隆命名為S9pGEM。

1.2.3

SRBSDV病毒S9基因的生物信息學(xué)分析。將獲得的S9基因序列在NCBI上作Blast分析，并比較其與其他地區(qū)S9基因之間的同源性。用ClustalW進(jìn)行DNA和氨基酸的多序列比對(duì)，確認(rèn)差異位點(diǎn)，并進(jìn)行進(jìn)化分析。

表1 用于檢測(cè)SRBSDV及構(gòu)建載體的引物序列

引物名稱引物序列（5'～3'）酶切位點(diǎn)

S10FCGA TCT TAT CCA TAA TGG TG

S10R GCC ATA GTG TGT CAC GTC TG

RS10FAAGGAAACATTACTTTGAAGCC

RS10RTGGTCAATTCATATTCATCTGG

S9iFCGGGGTACCGAACGCAAGAGAATGGCAGACC Kpn I

S9iRCGCGGATCCCAATAGAAACCAATAATGGACGABamH I

1.2.4

SRBSDV S9雙元抑制載體的構(gòu)建。將S9pGEM和載體pDS1301質(zhì)粒均使用BamH I和Kpn I雙酶切，回收外源片段和酶切后的pDS1301載體。然后將它們等摩爾比混合連接，得到的陽性克隆命名為S9ds1。再將S9pGEM和S9ds1質(zhì)粒均用Spe I和Sac I雙酶切，分別回收外源片段和S9ds1載體，等摩爾比混合連接。獲得陽性克隆即S9雙元抑制載體，命名為pDS301S9。雙酶切體系為：2種限制性內(nèi)切酶（BamH I和Kpn I）各2 μl，10×buffer 2.5 ?μl，質(zhì)粒為20 ?μl，用ddH2O補(bǔ)足至50 ?μl，37 ℃酶切3 h。用Spe I和Sac I雙酶切時(shí)，10×buffer 5 ?μl，其余相同。連接體系：利用微量核酸濃度測(cè)定儀，測(cè)定回收產(chǎn)物的濃度，分別計(jì)算載體和外源片段的摩爾數(shù)。10×連接buffer 1 ?μl，連接酶1 ?μl，根據(jù)計(jì)算結(jié)果決定外源和載體的體積，其余補(bǔ)足ddH2O至10 ?μl。電轉(zhuǎn)DH10B感受態(tài)后，涂帶有卡那霉素抗性的LB皿，篩選陽性克隆。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 湖北省SRBSDV發(fā)病植株的鑒定

自從南方各個(gè)稻作區(qū)暴發(fā)SRBSDV以來，湖北省作為主要水稻產(chǎn)區(qū)也發(fā)現(xiàn)有疑似SRBSDV的發(fā)生，但長(zhǎng)期以來認(rèn)為是另一種病毒病RBSDV。2010年在崇陽采集疑似病株進(jìn)行鑒定（圖1），結(jié)果

顯示湖北省崇陽病毒病疑似植株應(yīng)是SRBSDV，不是RBSDV。應(yīng)用相同的方法檢測(cè)鄂州和武漢水稻田疑似病株，結(jié)果相同，表明湖北省發(fā)生的與RBSDV癥狀高度相似的矮縮病為SRBSDV。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與SRBSDV的CP同源性高達(dá)99%（結(jié)果未顯示）也證實(shí)了這一點(diǎn)。

注：1、2、3為不同的病株，CK1為陽性對(duì)照，CK2為陰性對(duì)照。

圖1 湖北省崇陽水稻矮縮植株RTPCR鑒定

2.2 S9基因片段的獲取

以SRBSDV水稻病株cDNA作為模板，以S9iF和S9iR為引物，擴(kuò)增獲取了703 bp的基因片段S9（圖2A）。PCR擴(kuò)增獲取的片段與預(yù)期大小相同。將擴(kuò)增基因片段連接到pGEMGZ載體上（圖2B），并命名為S9pGEM，結(jié)果表明，所克隆片段為SRBSDV S9基因的部分序列[10]，進(jìn)一步證實(shí)了前面的結(jié)果。

注：A.S9iF和S9iR PCR產(chǎn)物;B.S9pGEMGZ克隆BamH I、Kpn I雙酶切鑒定。

圖2 湖北省SRBSDV病毒S9基因片段的克隆

2.3 RNA干涉載體pDS1301S9的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpn I雙酶切S9pGEM和pDS1301質(zhì)粒，獲取了S9基因帶有BamH I和Kpn I酶切位點(diǎn)接頭的外源片

注：A.S9第1鏈連接到pDS1301，BamH I和Kpn I雙酶切檢測(cè);B.S9第2鏈連接到pDS1301上，BamH I和Kpn I雙酶切檢測(cè)，5、7、9是陽性克隆;C.S9雙鏈抑制載體示意。

圖3 pDS1301S9載體構(gòu)建酶切檢測(cè)結(jié)果

段和載體，回收連接后S9基因片段定向插入pDS1301載體上，獲得陽性克隆，命名為S9ds1（圖3A）。此載體上帶有S9基因的第一鏈，還需要連接一個(gè)反向的第二鏈。用限制性內(nèi)切酶Spe I和Sac I雙酶切S9pGEM和S9ds1，回收連接后S9基因片段反向插入S9ds1上，即完成了pDS1301S9的構(gòu)建（圖3B），構(gòu)建的載體結(jié)構(gòu)見圖3C。

3 討論

將水稻黃斑駁病毒（Rice yellow mottle virus， RYMV）復(fù)制所需酶的基因部分序列構(gòu)建RNAi載體轉(zhuǎn)化水稻，誘發(fā)基因沉默，使水稻具有RYMV抗性，且抗性能穩(wěn)定遺傳[11]。利用大麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus， BYDV）的復(fù)制酶基因片斷為靶位點(diǎn)構(gòu)建RNAi載體，并將其導(dǎo)入大麥，在25個(gè)轉(zhuǎn)化系中，有9個(gè)轉(zhuǎn)化系表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，且穩(wěn)定遺傳的2個(gè)株系后代中， 用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)不到接種病毒的存在[12]。水稻對(duì)SRBSDV缺乏抗性品種，利用RNAi技術(shù)創(chuàng)建抗病新種質(zhì)是一種有效的手段。該研究選擇SRBSDV的S9基因作為靶標(biāo)創(chuàng)建新種質(zhì)，這是因?yàn)镾9是SRBSDV病毒一個(gè)重要的基因，且與RBSDV病毒中的S9基因具有76%以上的同源性。RNA干涉的機(jī)制表明同源基因同源性達(dá)到70%以上時(shí)，雙鏈RNA產(chǎn)生的小RNA可以干涉同源基因的表達(dá)。所以利用SRBSDV病毒S9基因構(gòu)建的RNAi載體創(chuàng)制的轉(zhuǎn)基因水稻植株可能具備SRBSDV和RBSDV抗性，為進(jìn)一步研究用一種病毒的基因序列進(jìn)行RNA干涉從而創(chuàng)制抗2種病毒的水稻新種質(zhì)提供研究基礎(chǔ)。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2014年

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