孫妍 趙紅盈 宋小雙 遇文婧

摘要 [目的]探討豚草提取物對楊樹爛皮病病原菌的抑制作用，為生物源農(nóng)藥的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。[方法]采用溫浸-超聲波連用提取法對豚草活性物質(zhì)進行了提取，并研究了提取物對楊樹爛皮病病原菌的抑制作用。[結(jié)果]不同濃度豚草提取物均對楊樹爛皮病病原菌具有較強的抑制作用并呈線性增長趨勢。[結(jié)論]豚草對真菌具有一定的抑制作用，且對生態(tài)環(huán)境及哺乳動物無害。

關(guān)鍵詞 豚草;超聲波;楊樹爛皮病病原菌

中圖分類號 S763.1 ?文獻標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2014）34-12111-02

Inhibition Effect of Crude Extracts of Ambrosia artemisiifolia L. against Cytospora chrysosperma

SUN Yan， ZHAO Hongying， SONG Xiaoshuang et al

（Heilongjiang Institute of Forest Protection，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to understand inhibition effect of crude extracts of A. artemisiifolia L. against C. chrysosperma to provide theoretical basis for development and utilization of biopesticide. [Method] Crude extracts of A. artemisiifolia L. Were obtianed by the method of warm immersion with ultrasonic， and inhibition effect of the crude extracts against C. chrysosperma was studied. [Result] Different concentrations of the crude extracts had strong inhibition to the C. chrysosperma and took on linear growth. [Conclusion] A. artemisiifolia L. has certain inhibition to fungi， and is safe for enriroment and mamals.

Key words Ambrosia artemisiifolia L.; Ultrasonic; Cytospora chrysosperma （Pers） Fr.

豚草[1]（Ambrosia artemisiifolia L.），又稱艾葉破布草、美洲艾，隸屬于菊科豚草屬，為1年生草本植物，高30～150 cm，直徑2.5～5.0 mm。其生命力強，易于傳播，種子可隨作物、水流及交通工具攜帶進行傳播。豚草原產(chǎn)于墨西哥北部的索諾蘭沙漠地區(qū)和美國西南部，并在俄羅斯、美國、英國、日本等國家均有廣泛分布。約于20世紀(jì)30年代傳入我國東北地區(qū)，近幾年隨著國內(nèi)外交流的日益增多，豚草的種子也隨之傳播到我國各地，并且迅速蔓延，并在華東、華中、華北、東北等至少15個?。▍^(qū)）都有發(fā)現(xiàn)，一些地區(qū)雖然已經(jīng)大規(guī)模的拔除，但一些路邊及河道仍有不少殘余，且在不斷蔓延。

豚草多生長于荒山空地、路邊、溝旁、田塊周圍或農(nóng)田中，可遮蓋和壓抑作物，阻礙農(nóng)業(yè)操作，與作物爭地爭水，影響作物產(chǎn)量，吸入其花粉還可使人患上呼吸系統(tǒng)疾病，因此它是一種既影響人類健康又影響農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的危險性雜草，其繁殖快，危害大，為世界上公認(rèn)的有害植物之一，并素有“植物殺手”之稱，是國內(nèi)外重點檢疫對象。

楊樹爛皮病[2][Cytospora chrysosperma（Pers.）Fr.]，又稱潰瘍病、腐爛病、臭皮病，病原為污黑腐皮殼（Valsa sordida Nit），屬子囊菌綱球殼菌目間座殼菌科污濁腐皮殼屬，通常以無性世代出現(xiàn)。楊樹爛皮病是綠地、公園、行道樹和苗圃楊樹的常見病和多發(fā)病，經(jīng)常引起行道樹的大量枯死，新移栽的楊樹發(fā)病尤為嚴(yán)重。該病在我國的楊樹栽培區(qū)均有發(fā)生，但主要分布在東北、西北、華北等地。近幾年，該病的發(fā)生量及發(fā)生程度呈上升趨勢[3]。國外對豚草屬植物研究結(jié)果表明，該屬植物中含有豐富的倍半萜內(nèi)酯類化合物，可嘗試作為生物源農(nóng)藥進行研究[4]。為此，筆者利用溫浸-超聲波連用提取法對豚草的抑菌活性物質(zhì)進行了提取，并研究了該提取物對楊樹爛皮病病原菌的抑制作用及對小白鼠的安全性，旨在為豚草的生物源農(nóng)藥的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試植物。供試豚草采自黑龍江省牡丹江市。將新鮮的豚草清洗干凈，先在通風(fēng)處陰干，然后放入干燥箱中，50 ℃烘干至恒重，用分析型研磨機研磨粉碎，保存于棕色瓶中，備用。

1.1.2 供試菌種。供試楊樹爛皮病菌種由發(fā)病楊樹上分離鑒定得到。

1.2 方法

1.2.1 植物提取物母液的制備[5-6]。

取10 g豚草植物粉末，裝入300 ml三角瓶中，加入80%乙醇250 ml，置于50 ℃恒溫水浴鍋中溫浸3 h，取出后放到超聲波提取器中振蕩40 min，然后再置于50 ℃恒溫水浴鍋中溫浸3 h，最后將浸好的藥液用真空泵反復(fù)減壓抽濾，得到澄清的乙醇粗提液。將乙醇粗提液在40 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮至原液呈現(xiàn)出濃油狀為止，用10%聚山梨酯80作為溶媒進行溶解定容至50 ml（即質(zhì)量濃度為200 mg/ml），物理滅菌后放入4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 豚草提取物抑菌活性測定方法。

1.2.2.1 PDA培養(yǎng)基的制備。

將洗凈去皮的馬鈴薯200 g切碎，加1 000 ml水煮沸30 min，然后用紗布過濾去除馬鈴薯，再加水定容至1 000 ml，加入18 g瓊脂和20 g蔗糖，加熱至瓊脂完全溶化，趁熱用紗布過濾并分裝于三角瓶中，在121 ℃下加壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.2.2.2 帶毒平板培養(yǎng)基的制備。

將豚草粗提液母液稀釋成0.25、1.00、4.00、20.00、40.00和80.00 mg/ml系列濃度梯度，分別量取一定量各濃度藥液加入到熱培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，冷凝后即成為帶活性物質(zhì)的培養(yǎng)基。

1.2.2.3 生長速率法測定抑菌率[7]。

用“1.2.2.2”制備的不同濃度含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，以病原菌菌絲的生長速率快慢判定不同樣品抑制效果的強弱。

用滅菌后的直徑為5 mm的打孔器在培養(yǎng)好的菌落外緣切下帶菌培養(yǎng)基菌餅。用酒精燈火焰滅菌后的接種針或消毒的鑷子將菌餅放置在帶毒培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，菌絲面向下，每皿接1塊，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h觀察一次，用十字交叉法測量菌落直徑2次，取平均值，計算菌絲生長抑制率。

菌落生長直徑（mm）=2次直徑平均值-5.0（菌餅直徑）

抑制率=（對照凈生長直徑-處理生長直徑）/對照凈生長直徑

1.2.3 豚草粗提物的安全性試驗。

選用體重在17～22 g的健康小白鼠，性別相同或雌雄各半。通過胃腸給藥的方式進行安全性試驗。

豚草提取物設(shè)5個劑量組，分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 ml，分組灌服不同劑量的受試小白鼠。為能得到理想的結(jié)果，試驗從中間劑量開始，以便從最初幾個劑量組動物接受藥物后的反應(yīng)來判斷兩端劑量是否合適，便于調(diào)整劑量和組數(shù)。為了提高試驗的精確度和節(jié)省藥物，受試藥物按“低比稀釋法”配制。給藥后逐日觀察并記錄小白鼠中毒反應(yīng)、死亡率和死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豚草提取物對楊樹爛皮病病原菌菌絲生長的抑制作用

由圖1可知，不同濃度的豚草提取物均在48 h后對楊樹爛皮病病原菌產(chǎn)生較強的抑制作用，并呈緩慢增長趨勢。0.25 mg/ml豚草提取物對楊樹爛皮病菌的平均抑菌率為45.67%，1.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為51.22%，4.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為53.92%，20.00 mg/ml豚草提取物平均抑菌率為60.57%，40.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為66.37%，80.00 mg/ml豚草提取物的平均抑菌率為85.13%?？梢?，當(dāng)豚草提取物濃度達到1.00 mg/ml以上時，抑菌率均達到50%以上，當(dāng)豚草提取物濃度達到80.00 mg/ml時，抑菌率達到85%以上。

圖1 不同濃度豚草提取物對楊樹爛皮病菌的抑制作用

2.2 豚草提取物對楊樹爛皮病病原菌抑制中濃度（EC50）的確定

由圖2可知，不同濃度豚草提取物對楊樹爛皮病菌的抑制作用呈線性增長趨勢，濃度越高，豚草提取物對楊樹爛皮病菌的抑制作用越大，其線性回歸方程為：y=0.442 8x+49.76，R2=0.970 3，相關(guān)性良好，由此得出豚草提取物對楊樹爛皮病病原菌菌絲的EC50為542.005 mg/L。

圖2 豚草提取物對楊樹爛皮病菌的抑制作用線性關(guān)系

2.3 豚草粗提物對小白鼠的致死中量（LD50）的確定

采用改進寇氏法，得出豚草粗提液對小白鼠的LD50為7 466.299 mg/kg 。由圖3可知，豚草粗提物濃度對數(shù)與校正死亡率機率值成線性相關(guān)，其線性方程為：y=5.889 2x-17.809，R2=0.937 6，相關(guān)性良好。

圖3 豚草粗提液毒力測定線性關(guān)系

冀農(nóng)[8]根據(jù)農(nóng)藥LD50的多少可將農(nóng)藥的毒性分為以下5級：

劇毒農(nóng)藥，LD50為1～50 mg/kg（體重）;

高毒農(nóng)藥，LD50為51～100 mg/kg（體重）;

中毒農(nóng)藥，LD50為101～500 mg/kg（體重）;

低毒農(nóng)藥，LD50為501～5 000 mg/kg（體重）;

微毒農(nóng)藥，LD50為5 000 mg/kg（體重）以上。

根據(jù)該農(nóng)藥毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，豚草粗提物的LD50大于5 000 mg/kg，為微毒，對生態(tài)環(huán)境及哺乳動物無害，可作為植物源農(nóng)藥進行開發(fā)。

3 結(jié)論

豚草作為入侵植物，近些年來對其治理的研究報道較多，而對于其開發(fā)和利用的研究極少，該研究試圖挖掘其可利用價值，使其變廢為寶，以達到以用為治的目的。

植物有效成分的提取多采用單一方法，提取率較低，該研究嘗試運用2種方法相結(jié)合的方式來提取豚草的抑菌粗提物，并研究其對楊樹爛皮病病原菌菌絲的抑制作用。

將浸漬法與超聲波技術(shù)相接合的技術(shù)應(yīng)用于豚草活性物質(zhì)的提取，不僅可保持有效成分的活性，同時可節(jié)省時間，簡化提取純化流程，提高提取效率，且該方法易于推廣。豚草的80%乙醇浸漬-超聲波連用技術(shù)的提取物對楊樹爛皮病原菌的抑制試驗結(jié)果表明，豚草提取物對楊樹爛皮病病原菌有較強的抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度在80.00 mg/ml時，抑菌率達到85%以上，且提取物的濃度與抑制作用呈正相關(guān)，其抑制率呈線性增長趨勢，依據(jù)農(nóng)藥毒性等級，該提取物為微毒。由

此得出，豚草對真菌具有一定的抑制作用，且對生態(tài)環(huán)境及