曹翠　宋瑞清　周秀華

摘要 [目的]確定1株云杉八齒小蠹伴生藍(lán)變真菌C59的分類地位。[方法]對(duì)分離自伊春市五營(yíng)區(qū)黑龍江豐林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)紅皮云杉林內(nèi)的一株云杉八齒小蠹伴生藍(lán)變菌株進(jìn)行培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)特征觀察和18S rDNA ITS序列分析鑒定，在對(duì)該藍(lán)變菌株進(jìn)行接種的同時(shí)，測(cè)定了該菌株的致病性，苗木感病后韌皮部的水分代謝，針葉葉綠素含量，韌皮部可溶性糖、蛋白質(zhì)、MDA和脯氨酸含量。[結(jié)果]該藍(lán)變菌株為Ophiostoma sp.，該菌株使接種苗木韌皮部發(fā)生藍(lán)變，影響苗木韌皮部的水分代謝，導(dǎo)致苗木針葉葉綠素含量、韌皮部可溶性糖含量、韌皮部蛋白質(zhì)含量下降，使苗木韌皮部MDA含量和脯氨酸含量上升。[結(jié)論]分離自伊春市五營(yíng)區(qū)黑龍江豐林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)紅皮云杉上的云杉八齒小蠹伴生藍(lán)變菌株為Ophiostoma sp.，該菌株對(duì)紅皮云杉苗木具有很強(qiáng)的致病性。

關(guān)鍵詞 紅皮云杉；藍(lán)變菌株；鑒定；致病性

中圖分類號(hào) S763 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）03-00749-06

Abstract [Objective] The taxonomic status of blue-stain fungal strain associated with Ips typographus isolated from Picea koraiensis was determined. [Method] The blue-stain fungal strain associated with Ips typographus isolated from Picea koraiensis in Heilongjiang Fenglin National Nature Reserve of Wuying district of Yichun city， was identified as Ophiostoma sp. based on culture characteristics， morphological features and 18S ITS sequence analysis. [Result] The result of pathogenicity test showed that the blue-stain fungal strain can make the phloem color of the inoculated seedlings turn to blue； affect water metabolism of seedling phloem； cause chlorophyll content， soluble sugar content and protein content decreased； and led MDA levels and proline content increased. In conclusion， Ophiostoma sp. [Conclusion] The blue-stain fungal strain associated with Ips typographus， isolated from Picea koraiensis in Heilongjiang Fenglin National Nature Reserve of Wuying district of Yichun city has a strong pathogenicity to Picea koraiensis.

Key words Picea koraiensis； Blue-stain fungal strain； Identification； Pathogenicity

紅皮云杉（Picea koraiensis）是我國(guó)東北地區(qū)的鄉(xiāng)土樹(shù)種，是長(zhǎng)白山至小興安嶺森林的主要組成樹(shù)種之一。紅皮云杉木材輕軟、細(xì)致，可供建筑、家具、造紙等用材。其樹(shù)姿優(yōu)美，抗感染力強(qiáng)，又是城市觀賞、綠化較佳的樹(shù)種。因此，紅皮云杉是我國(guó)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值均很高的樹(shù)種之一。

木材藍(lán)變是針葉材價(jià)值損失的主要原因之一[1]。木材藍(lán)變主要由具有暗色菌絲的真菌引起，少數(shù)真菌分泌著色物質(zhì)使細(xì)胞壁變色。Bridges和Christiansen等研究認(rèn)為被害寄主樹(shù)木的死亡是小蠹蟲(chóng)和共生真菌聯(lián)合作用的結(jié)果，而寄主樹(shù)木木質(zhì)部組織的藍(lán)變和迅速壞死則主要由真菌所致[2-3]。變色菌引起的變色只滲入木材表面，幾乎僅局限于邊材，沒(méi)有或很少與心材有關(guān)，故又稱邊材變色[4]。大量研究已證明了藍(lán)變對(duì)木材產(chǎn)品性質(zhì)的影響。木材變色菌雖然不會(huì)導(dǎo)致木材腐朽，但是會(huì)使木材變黑、變青或變藍(lán)，導(dǎo)致材面污染。木材藍(lán)變后，除了邊材的滲透性增加，還會(huì)使木材沖擊彎曲強(qiáng)度受損。木材藍(lán)變嚴(yán)重降低木材的使用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，給林業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)造成巨大的損失。

筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)在黑龍江豐林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的紅皮云杉林內(nèi)分離的1株云杉八齒小蠹伴生藍(lán)變真菌C59 [5]進(jìn)行形態(tài)學(xué)和18S rDNA ITS序列分析，以確定其分類地位，同時(shí)對(duì)菌株C59的致病性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)變菌株C59：試驗(yàn)菌株分離自黑龍江豐林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)云杉八齒小蠹坑道內(nèi)。

接種植物：選自哈爾濱市市郊柳樹(shù)林苗圃的紅皮云杉8年生健康苗木。

1.2 藍(lán)變菌株的鑒定

1.2.1 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)研究。

（1）培養(yǎng)特性研究。將藍(lán)變菌株接種于改良PDA平板培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 ml）上，24～25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)。觀察菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)。

（2）形態(tài)特征研究。用改良PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)藍(lán)變菌株直至產(chǎn)孢。顯微鏡下觀察分生孢子梗、菌絲、分生孢子、子囊殼、子囊孢子等形態(tài)特征以及分生孢子的著生方式，照相記錄。

1.2.2 18S rDNA ITS序列。

DNA提取采用CTAB法[6]，采用真菌的通用引物進(jìn)行rDNA ITS序列擴(kuò)增，引物ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3（20）和ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3（20），由大連寶生物有限公司合成。

PCR擴(kuò)增在Gene Amp PCR System 9700 PCR儀上進(jìn)行，20 μl的反應(yīng)體系擴(kuò)增條件為：20 μl的反應(yīng)體系中去離子水11.7 μl，10 ×PCR buffer（含Mg2+ ）2.0 μl，dNTP（ 2.5 mmol/L）2.0 μl，ITS1（20 μmol/L）1.0 μl，ITS4（20 μmol/L）1.0 μl，Taq酶（5 μ/μl）0.3 μl，DNA模板（20 μl）2.0 μl。

PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min，每次反應(yīng)均設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照，以去離子水代替模板，以排除系統(tǒng)誤差。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖（含0.5 μg/ml EB）電泳，在UVP凝膠成像系統(tǒng)下成像保存[7]。

PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將測(cè)得的ITS序列在GenBank 進(jìn)BLAST，從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得相似率較高、親源關(guān)系較近的物種，研究其中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。通過(guò)DNA MAN及DNAClub軟件對(duì)所需要的序列進(jìn)行調(diào)整，以UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetric Mean）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 致病性測(cè)定

1.3.1 接種體的制備。

用直徑10 mm無(wú)菌打孔器，在無(wú)菌條件下切取改良PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的藍(lán)變菌株菌落，接種于盛有250 ml改良PD液體培養(yǎng)基的三角瓶（500 ml）中，每瓶接種6片。置25 ℃轉(zhuǎn)速150 r/min搖床中培養(yǎng)15 d后，用墊有雙層無(wú)菌濾紙的布氏漏斗真空抽濾，濾去菌絲即得接種體原液。

1.3.2 接種。采用針刺后涂抹接種體的方式接種。

在距地面5～20 cm苗木莖部，由上至下按相等間距分別設(shè)1、2、4個(gè)接種點(diǎn)，每個(gè)接種點(diǎn)接種接種體0.1 ml。接種后用塑料薄膜保濕。分別以針刺后不接種（CK1）、針刺后接種無(wú)菌液體培養(yǎng)基（CK2）和無(wú)處理（CK3）作為對(duì)照。每處理設(shè)置7個(gè)重復(fù)。

1.3.3 接種后觀測(cè)及生理生化指標(biāo)測(cè)定。

分別在接種后的第1、7、14、21、28天測(cè)定針葉葉綠素含量并觀測(cè)接種點(diǎn)上下韌皮部反應(yīng)區(qū)的縱向長(zhǎng)度。葉綠素含量測(cè)定采用乙醇-丙酮混合浸泡法[8]，韌皮部反應(yīng)區(qū)長(zhǎng)度的測(cè)量采用直尺測(cè)量，重復(fù)3次取其平均值[9]。

28 d測(cè)定各處理苗木韌皮部其他生理生化指標(biāo)。水分含量測(cè)定采用常壓加熱干燥法[9]，可溶性糖測(cè)定采用蒽酮比色法[8]，可溶性蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[8]，丙二醛采用硫代巴比妥酸法[8]，游離脯氨酸測(cè)定采用茚三酮比色法[8]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析。

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用單因素簡(jiǎn)單方差分析（one-way ANOVA）處理，如處理間有顯著差異性存在，進(jìn)一步應(yīng)用最小顯著差數(shù)法（Least Significant Difference，LSD）做多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)變菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)特征。

2.1.1.1 培養(yǎng)特性。菌株在改良PDA平板培養(yǎng)基（直徑為90 mm）上生長(zhǎng)7 d可長(zhǎng)滿平板。菌落呈毛氈狀較稠密，氣生菌絲較少；初為灰白色，后變?yōu)榛易厣?。在菌落中心形成黑色圈，無(wú)氣味。在改良PDA培養(yǎng)基上未見(jiàn)子囊果形成。

2.1.1.2 形態(tài)學(xué)特征。菌絲直或彎曲且有隔，有的有分支。分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，褐色，長(zhǎng)300～600 μm，有分支。分生孢子單細(xì)胞，大小5～8 μm×18～24 μm，淺色，長(zhǎng)形，偶爾稍彎曲或一段稍尖，原生質(zhì)分裂成數(shù)團(tuán)（圖1）。

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 苗木韌皮部變色反應(yīng)。

小蠹蟲(chóng)伴生菌通過(guò)小蠹蟲(chóng)的蛀害被攜帶進(jìn)入寄主樹(shù)木組織內(nèi)，并在樹(shù)體中生長(zhǎng)繁殖，消耗樹(shù)木養(yǎng)分，破壞韌皮細(xì)胞，使韌皮組織壞死，在韌皮部形成1個(gè)長(zhǎng)橢圓形的棕褐色壞死區(qū)域即韌皮反應(yīng)區(qū)，反應(yīng)區(qū)的長(zhǎng)度常用衡量菌所產(chǎn)生的致病力強(qiáng)弱，反應(yīng)區(qū)越長(zhǎng)，伴生菌的致病力越強(qiáng)，反應(yīng)區(qū)越短，表示伴生菌的致病力越弱[10]。

接種后第1、7、14、21、28天，菌株C59接種苗木其接種點(diǎn)周圍的韌皮組織逐漸形成1個(gè)縱向、長(zhǎng)橢圓形、棕褐色壞死區(qū)域，即韌皮部抗性與生理反應(yīng)區(qū)。韌皮反應(yīng)區(qū)長(zhǎng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，接種后1～21 d，反應(yīng)區(qū)長(zhǎng)度增長(zhǎng)較快（約0.27 cm/d），之后逐漸減慢，增長(zhǎng)約0.23 cm/d。CK1（針刺無(wú)接種）和CK2（針刺后接種PD液體培養(yǎng)基）苗木其接種點(diǎn)的反應(yīng)區(qū)長(zhǎng)度變化很小，尤其CK1苗木機(jī)械損傷區(qū)更小（圖3）。

對(duì)照CK1接種點(diǎn)的反應(yīng)區(qū)為接種時(shí)機(jī)械傷害所致，因此機(jī)械傷害作用較??；而接種菌株C59苗木所形成的較大反應(yīng)區(qū)是菌株C59的侵染所導(dǎo)致。另外，CK2苗木反應(yīng)區(qū)稍大于CK1苗木。這表明無(wú)菌培養(yǎng)液對(duì)韌皮部變色有一定影響。有關(guān)無(wú)菌培養(yǎng)液對(duì)韌皮部變色的影響有待進(jìn)一步研究。

2.2.3.3 接種時(shí)間對(duì)不同接種苗木葉綠素含量的影響。

隨著接種后時(shí)間的增長(zhǎng)，各處理苗木葉綠素含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)不同（圖11）。

CK1-1和CK1-2葉綠素含量呈現(xiàn)下降-上升-急速下降趨勢(shì)。處理后第1天，與CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4葉綠素含量分別下降0.84%、4.64%、2.36%；接種后第21天，CK1-1葉綠素含量上升1.6個(gè)百分點(diǎn)，CK1-2和CK1-4分別下降8和21個(gè)百分點(diǎn)，之后急速下降；處理后第28天CK1-1、CK1-2和CK1-4葉綠素含量分別下降21.9、36.8、43.0個(gè)百分點(diǎn)。

CK2葉綠素含量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。處理后第1天，CK2-1、CK2-2和CK2-4的葉綠素含量分別下降5.1、8.5、15.5個(gè)百分點(diǎn)，第28天分別下降42.6、50、59.4個(gè)百分點(diǎn)。

接種C59苗木其葉綠素含量則呈逐漸急速下降-平穩(wěn)下降的趨勢(shì)。接種后第1天，C59-1、C59-2和C59-4葉綠素含量分別下降3.8、17.4、12.8個(gè)百分點(diǎn)，之后急速下降；第7天分別下降31.0、37.4、45.0個(gè)百分點(diǎn)，之后下降較平穩(wěn)；第28天下降率分別為57.5、62.7、65.8個(gè)百分點(diǎn)。

上述結(jié)果一方面可能是由于真菌侵染引起苗木樹(shù)勢(shì)衰弱和代謝紊亂，導(dǎo)致苗木的光合能力逐步下降，使葉綠素的生物合成速度減緩；另一方面可能是菌株侵染危害引起植物體內(nèi)活性氧（如O2-·、H2O2、·OH和O2等）的積累和水分的缺乏[12]，導(dǎo)致葉綠素分解加快，分解速率大于合成速率，進(jìn)而使葉片逐漸失綠。

2.2.4 苗木韌皮部可溶性糖的變化。

2.2.4.1 不同處理對(duì)苗木韌皮部可溶性糖含量的影響。

可溶性糖是植物體內(nèi)重要的能源儲(chǔ)備物，與植物組織的代謝合成有密切關(guān)系。不同處理對(duì)苗木韌皮部可溶性糖含量的影響顯著（圖12）。CK3可溶性糖含量最高，CK1和CK2次之，接種C59苗木可溶性糖含量最低。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是：①菌株C59在苗木韌皮部、木質(zhì)部間蔓延，使苗木的物質(zhì)合成和代謝受阻，特別是光合作用產(chǎn)物的運(yùn)輸嚴(yán)重受阻，從而使苗木韌皮部碳水化合物等儲(chǔ)備物減少；②菌株C59的侵染引起苗木長(zhǎng)勢(shì)衰弱、針葉失水、枯萎脫落等勢(shì)必導(dǎo)致苗木光合能力逐步下降，進(jìn)而引起碳水化合物合成和代謝發(fā)生變化，使苗木韌皮部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量降低；③可溶性糖含量下降也與菌株C59侵染苗木后分解木質(zhì)部薄壁細(xì)胞和利用木質(zhì)部管胞胞間和薄壁細(xì)胞內(nèi)多糖等物質(zhì)有密切關(guān)系。

2.2.4.2 接種點(diǎn)數(shù)量對(duì)苗木韌皮部可溶性糖含量影響。

接種點(diǎn)數(shù)量與苗木可溶性糖含量呈明顯的負(fù)相關(guān)（圖12）。接種后28 d，與CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4可溶性糖含量分別下降了2.38、3.49和12.79個(gè)百分點(diǎn)，CK2-1、CK2-2和CK2-4分別下降了5.81、10.47、23.26個(gè)百分點(diǎn)。接種C59苗木C59-1、C59-2和C59-4則分別下降了38.40、63.00、71.00個(gè)百分點(diǎn)。

隨著針刺點(diǎn)數(shù)的增加，苗木受機(jī)械損傷的面積增大，導(dǎo)致可溶性糖含量下降，這一結(jié)果與黃瓜植株機(jī)械損傷后期可溶性糖含量下降的結(jié)果一致[13]，可溶性糖含量下降說(shuō)明可溶性糖對(duì)降低滲透勢(shì)、維持細(xì)胞膨壓的貢獻(xiàn)大，從而抵抗針刺的損傷。而對(duì)于接種C59苗木，除了機(jī)械損傷面積增大外，也增加接種C59的量，因此對(duì)苗木傷害的嚴(yán)重程度增大。對(duì)CK2來(lái)講，無(wú)菌培養(yǎng)液中本身就含有可溶性糖，因此隨著接種無(wú)菌培養(yǎng)液量的增加，導(dǎo)致CK2-4可溶性糖含量高于CK1-4。

2.2.5 苗木韌皮部蛋白質(zhì)含量的變化。

2.2.5.1 不同處理對(duì)苗木韌皮部蛋白質(zhì)含量的影響。

不同處理對(duì)苗木韌皮部蛋白質(zhì)含量的影響顯著（圖13）。CK3蛋白質(zhì)含量最高，CK1、CK2均下降程度小，而接種C59苗木蛋白質(zhì)含量下降程度最大。

2.2.5.2 接種點(diǎn)數(shù)量對(duì)苗木韌皮部蛋白質(zhì)含量影響。

除C59-4外，接種點(diǎn)數(shù)量與苗木蛋白質(zhì)含量呈明顯的負(fù)相關(guān)。處理后28 d，與CK3相比，CK1-1、CK1-2和CK1-4蛋白質(zhì)含量分別下降了25.6、31、33.1個(gè)百分點(diǎn)，CK2-1、CK2-2和CK2-4分別下降了22.3、36.9、48.3個(gè)百分點(diǎn)，C59-1、C59-2分別下降了52.4、75.0個(gè)百分點(diǎn)。這表明機(jī)械損傷和病原菌絲在韌皮部、木質(zhì)部管胞和木射線薄壁細(xì)胞等組織和細(xì)胞內(nèi)的大量蔓延造成苗木的物質(zhì)合成和代謝紊亂或阻斷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量減少，另一方面溶酶體的破裂加速了蛋白質(zhì)的降解[14]。試驗(yàn)中出現(xiàn)了C59-4蛋白質(zhì)含量下降率低于C59-2的結(jié)果，原因可能與接種苗木自身產(chǎn)生免疫蛋白有關(guān)。

2.2.6.2 接種點(diǎn)數(shù)量對(duì)苗木韌皮部MDA含量影響。

接種點(diǎn)數(shù)量與苗木MDA含量呈明顯的正相關(guān)。處理后28 d，與CK3相比，CK1-1 MDA含量下降了10.6%，CK1-2、CK1-4、CK2-1和CK2-2 MDA含量均增加，但上升幅度不明顯，分別為10.6%、65.8%、16.6%和39.3%。CK2-4 MDA含量上升的幅度較大，為102.2%。C59-1、C59-2、C59-4的MDA含量分別上升了76.1%、139.6%、247.7%；C59的2點(diǎn)、4點(diǎn)接種處理顯著高于1點(diǎn)接種處理。這表明不同程度危害可誘發(fā)苗木細(xì)胞膜中自由基引起膜脂過(guò)氧化作用，使細(xì)胞膜損傷的同時(shí)造成了過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的大量產(chǎn)生和不斷累積。

2.2.7 苗木韌皮部脯氨酸的變化。脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組成成分之一，并以游離態(tài)廣泛存在于植物體中[15]。脯氨酸被認(rèn)為是植物逆境脅迫的產(chǎn)物，在逆境脅迫下植物體內(nèi)游離脯氨酸積累是一個(gè)普遍現(xiàn)象，脯氨酸的含量也可作為植物生理抗逆性指標(biāo)。植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但當(dāng)遭受逆境脅迫時(shí)，游離脯氨酸便會(huì)積累，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。它既可能有適應(yīng)性意義，又可能是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損傷的表現(xiàn)，也有依據(jù)說(shuō)明脯氨酸在逆境脅迫下的積累，是對(duì)逆境脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)[16]。也有研究證明，脯氨酸積累與組織內(nèi)碳水化合物含量有一定關(guān)系[17]，植物體內(nèi)缺水時(shí)可導(dǎo)致代謝產(chǎn)物脯氨酸的積累。植株體內(nèi)脯氨酸含量越高說(shuō)明越能夠從環(huán)境中吸取水分供植株生長(zhǎng)之用。

不同處理對(duì)苗木韌皮部脯氨酸含量的影響顯著（圖15）。CK3脯氨酸含量最低，CK1、CK2次之，接種C59苗木脯氨酸含量最高。

接種點(diǎn)數(shù)量與苗木脯氨酸含量呈明顯的正相關(guān)。處理后28 d，與CK3相比，CK1-1、CK1-2、CK1-4韌皮部脯氨酸含量分別增加7.1、16.2和48.4個(gè)百分點(diǎn)，CK2-1、CK2-2、CK2-4分別增加12.9、31.7和146.0個(gè)百分點(diǎn)，C59-1、C59-2、C59-4分別增加52.8、112.7和331.7個(gè)百分點(diǎn)。接種菌株C59苗木的4點(diǎn)接種處理均顯著高于1點(diǎn)、2點(diǎn)接種處理。

上述結(jié)果顯示，隨著機(jī)械損傷程度的提高，苗木韌皮部脯氨酸含量增加，表明游離脯氨酸含量的積累是對(duì)傷害脅迫適應(yīng)性反應(yīng)，是誘導(dǎo)抗性機(jī)制的一部分。隨著菌株C59接種量的增加，4點(diǎn)接種處理的脯氨酸含量顯著高于1點(diǎn)和2點(diǎn)接種處理，結(jié)果可能是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損傷的表現(xiàn)。苗木含水量的不斷下降也導(dǎo)致脯氨酸的積累。綜上，由于機(jī)械損傷和病原菌的刺激激發(fā)了苗木內(nèi)部的防御機(jī)制，使苗木表現(xiàn)出了對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。

另外，試驗(yàn)結(jié)果還顯示相同接種點(diǎn)數(shù)的CK2苗木韌皮部脯氨酸含量均高于CK1苗木，可能是無(wú)菌培養(yǎng)液對(duì)苗木生長(zhǎng)和代謝有一定的影響，尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

（1）經(jīng)形態(tài)學(xué)與18S rDNA ITS序列分析，將采自黑龍江豐林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)紅皮云杉林內(nèi)的1株云杉八齒小蠹伴生藍(lán)變真菌鑒定為蛇口殼屬真菌（Ophiostoma sp.）。該菌對(duì)紅皮云杉苗木具有很強(qiáng)的致病性。

（2）蛇口殼屬（Ophiostoma Syd.& P.Syd.）建于1919 年[18]，是經(jīng)濟(jì)上重要的病原真菌，許多種都能引起木材變色，如O.piliferum（Fr.）Syd.& P.Syd.和O.ips（Rumbold）Nannf.是較普遍的木材變色真菌，O.ulmi（Buisman）Nannf.是榆樹(shù)荷蘭病的病原菌，O.aenigmaticum K.Jacobs 是從日本云杉上首次分離到的[19]。目前，我國(guó)報(bào)道該屬真菌6種，包括3種 [O.abietinum Marm.& Butin、O.davidsonii（Olchow.& I.Reid）H.Solheim 和O.francke-grosmanniae（R.W.Davidson）deHoog & R.J.Scheff.]分離自馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）和黑松（Pinus thubergii Parl.）木材，2種[O.pinicola G.H.Zhao（nom.nud.）、O.lignicola（Wollenw.）Goid.]分離自馬尾松藍(lán)變木材[20-22]和從云南松（Pinus yunnanensis Franch.）木材中獲得的O.minus（Hedgc.）Syd.& P.Syd.[23]。唐明、葉輝等對(duì)蛇口殼目真菌、真菌與蠹蟲(chóng)的關(guān)系進(jìn)行了研究[24-25]。

（3）科學(xué)家已從被云杉八齒小蠢致死的云杉邊材中分離出幾種能引起藍(lán)色污斑的真菌。從藍(lán)色污斑前沿分離得到常見(jiàn)的2種真菌是Ceratocystis polonica（現(xiàn)名Ophiostoma polonicum）和C.penicillata（現(xiàn)名Ophiostoma penicillata）。接種結(jié)果顯示這些真菌能致死健康挪威云杉，在云杉八齒小蠢大發(fā)生期，它們是致死云杉的又一因子之一[26]。

（4）菌株C59（Ophiostoma sp.）接入紅皮云杉苗木后，菌絲在韌皮部和木質(zhì)部?jī)?nèi)管胞和木射線薄壁細(xì)胞等組織和細(xì)胞內(nèi)的大量蔓延，造成苗木物質(zhì)合成、光合作用和其他代謝紊亂或阻斷，特別是樹(shù)木水分和光合作用產(chǎn)物的運(yùn)輸嚴(yán)重受阻，導(dǎo)致針葉的葉綠素降解速率大于合成速率，葉綠素含量不斷減少；韌皮部水分及可溶性糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也不斷減少。筆者研究的結(jié)果與蒲曉娟2006年在華山松（Pinus armandi）的研究結(jié)果相一致。試驗(yàn)中出現(xiàn)的苗木蛋白質(zhì)含量隨著真菌接種點(diǎn)的增加、接種量的增大而提高的現(xiàn)象，可能與苗木自身產(chǎn)生免疫蛋白有關(guān)。

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