符群 彭亞文 王振宇

摘要

[目的]了解紅松多酚對免疫細(xì)胞功能的影響。[方法]采用MTT法研究了紅松多酚對大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響，以中性紅吞噬試驗(yàn)考察了紅松多酚對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響。[結(jié)果]研究表明，隨著給藥劑量的增加，紅松多酚對機(jī)體免疫細(xì)胞具有活性促進(jìn)作用。劑量濃度達(dá)到0.3 mg/ml時(shí)，脾淋巴細(xì)胞增殖呈現(xiàn)極顯著增加（P<0.01），腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬中性紅能力亦呈現(xiàn)極顯著增強(qiáng)（P<0.01）。并且在一定濃度范圍內(nèi)，作用效果均呈現(xiàn)劑量-效果關(guān)系。[結(jié)論]紅松多酚對于機(jī)體的免疫細(xì)胞活性具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞紅松；多酚；免疫

中圖分類號S609.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）28-09920-02

The Influence of Korean Polyphenols on Immune Cells Viability

FU Qun1， PENG Yawen1， WANG Zhenyu2*（1. School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Key words[Objective] To study the influence of Korean polyphenols on immune cells viability. [Method] This experiment used MTT method to study the influence of Korean polyphenols on spleen lymphocytes viability in rats and used the neutral red phagcytosis method to test the influence of Korean polyphenols on the peritoneal macrophages phagocytic ability. [Result] The result showed that， as the increasing of the dose， Korean polyphenols could significantly enhance the active of immune cells. When the concentration reached more than 0.3 mg/ml， the spleen lymphocytes increased remarkably （P<0.01） and the phagocytic ability of peritoneal macrophages on the neutral red increased remarkably （P<0.01）. And in some certain concentration， effects were present doseeffect relationship. [Conclusion] Korean polyphenols could enhance the viability of immune cells in the body.

Key wordsKorean pine； Polyphenols； Immune

隨著當(dāng)今社會的不斷發(fā)展，人們生活工作節(jié)奏日漸加快，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，人們的亞健康及患病機(jī)率也隨之大幅度增加。無論對于亞健康人群和患病人群，機(jī)體免疫能力的重要作用不亞于藥物本身的作用，而且完全依靠藥物治療，對機(jī)體的副作用往往不可忽視[1]。目前，國內(nèi)外研究者對于具有免疫功能的物質(zhì)的關(guān)注度不斷加強(qiáng)[2]，并致力于天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的研究。已有研究結(jié)論表明，紅松諸多部位可以作為人們祛病強(qiáng)身、延年益壽的藥食兩用材料，松屬植物具有較強(qiáng)免疫功能的生物活性，其中最主要的有效成分即為多酚類和多糖類[3-4]。我國紅松在東北地區(qū)分布較為廣泛，其種子由于營養(yǎng)豐富頗受人們歡迎，但是食用松仁之后，紅松種鱗殼則基本屬于廢棄物，紅松的種皮、樹皮、果鱗等不同部位皆含有不同量的多酚類化合物[5]，未能得到充分地利用，造成了資源的大量浪費(fèi)。筆者對紅松鱗片中的多酚物質(zhì)進(jìn)行研究，既實(shí)現(xiàn)了資源的高效利用，又對松多酚免疫作用進(jìn)行了初步研究，促進(jìn)其藥食用途的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1材料

紅松種鱗，2012年采自長白山地區(qū)（42°10′ N，126°32′ E）；Wistar大鼠，黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥物評價(jià)中心提供；RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司；MTT、ConA，均來自Sigma公司； Hanks液，北京百浩生物公司；中性紅染液、臺盼蘭，均來自南京森貝嘉生物公司。

1.2方法

1.2.1

紅松種鱗多酚的制備。

取紅松種鱗，粉碎過60目篩，以石油醚2次脫脂，稱取脫脂后的紅松種鱗2 g于100 ml燒杯中，加入60 ml 50%（V/V）乙醇，以1∶30（M/V）的料液比，60 ℃水浴下提取60 min。采用硅膠柱層析法，以甲醇為洗脫劑，將提取液純化，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，采用福林酚法[6]測定純化多酚含量，收集多酚冷凍干燥備用。

1.2.2

大鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖研究。

1.2.2.1

脾淋巴細(xì)胞的收集與培養(yǎng)。于無菌條件下取大鼠脾組織，去除脂肪等附著物，以無菌PBS液清洗3次。針筒塞輕輕磨碎脾組織，過200 目無菌篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，使其形成單個(gè)細(xì)胞。用PBS液洗滌細(xì)胞 2 次，每次3 ml，離心 10 min，速度為 1 000 r/min。然后將細(xì)胞重懸于1 ml 新鮮RPMI1640培養(yǎng)液中，用臺盼蘭染色法[7]記錄活細(xì)胞數(shù)量在95%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/ml[8]。

1.2.2.2

脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。將調(diào)整好濃度的脾淋巴細(xì)胞懸浮液分別加入到 96 孔培養(yǎng)板中，每孔95 μl，培養(yǎng)過夜。待脾細(xì)胞貼壁生長后，加入純化多酚，調(diào)整每水平的終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/ml，每水平中3孔加入5 μl ConA 溶液（使其終濃度為 7.5 μg/ml），另外3孔作為對照，加入5 μl PBS緩沖溶液，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入10 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，離心去除上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩培養(yǎng)15 min，使紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀在 490 nm 波長下測定反應(yīng)溶液的吸光度值[9]。

1.2.3

大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力研究。

1.2.3.1

巨噬細(xì)胞的收集與培養(yǎng)。無菌條件下腹腔注射10 ml 無菌Hanks 液，輕揉鼠腹，約10 min后，吸取液體收集至15 ml離心管中，離心棄上清，以RPMI1640培養(yǎng)基重新懸浮沉淀物[10]。

1.2.3.2

大鼠巨噬細(xì)胞吞噬增殖反應(yīng)試驗(yàn)。

調(diào)整細(xì)胞濃度每孔100 μl接種至96孔板中，培養(yǎng)過夜。待巨噬細(xì)胞貼壁后，加入純化多酚，調(diào)整每水平的終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/ml，各水平分別做3孔平行。培養(yǎng)24 h后，每孔加入中性紅100 μl，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30 min后，用Hanks 液清洗，4 ℃冰箱過夜后，在490 nm波長下，酶標(biāo)儀測定OD值[11]。

對于試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1大鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖研究

脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，富含 T、 B 淋巴細(xì)胞，加之其易于分離，是體外試驗(yàn)中淋巴細(xì)胞的重要來源。測定淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)是檢測淋巴細(xì)胞功能的常用方法。該試驗(yàn)采用MTT法對大鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行增殖試驗(yàn)，各劑量組吸光值結(jié)果如表1所示。

由表1可知，相比空白組，各紅松多酚劑量組對機(jī)體淋巴細(xì)胞均有促進(jìn)其增殖的作用。采用SPSS18.0軟件進(jìn)行組間差異性分析可知，當(dāng)紅松多酚劑量濃度達(dá)到0.3 mg/ml以上時(shí)，與空白組相比，淋巴細(xì)胞增殖的差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。而在0.1～0.4 mg/ml濃度范圍內(nèi)，也呈現(xiàn)差異的顯著性（P<0.05），且呈現(xiàn)劑量與效果之間的正相關(guān)關(guān)系。因此可知，紅松多酚對于淋巴免疫細(xì)胞體外有促進(jìn)增殖作用，且隨多酚濃度提高，刺激作用不斷增強(qiáng)，表明紅松多酚對脾淋巴細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)明顯劑量依賴性。

2.2大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能研究

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮中心作用。它可以直接吞噬外來異物及衰老的自身細(xì)胞，還可分泌白介素等細(xì)胞因子，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒、 抗腫瘤作用。紅松多酚干預(yù)后的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)吸光值數(shù)據(jù)如表2所示。

由表2數(shù)據(jù)可知，紅松多酚干預(yù)巨噬細(xì)胞后，對于巨噬細(xì)胞的吞噬功能有一定影響。以SPSS18.0軟件進(jìn)行顯著性分析可知，當(dāng)紅松多酚給藥濃度達(dá)到0.3 mg/ml以上時(shí)，巨噬細(xì)胞的吞噬功能與空白組相比，呈現(xiàn)極顯著的差異（P<0.01），而在0.1～0.2 mg/ml濃度范圍中未呈現(xiàn)顯著的差異。一般認(rèn)為，巨噬細(xì)胞的代謝狀況和其吞噬能力直接相關(guān)，代謝旺盛，則說明巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)；代謝減弱，則吞噬功能下降。因此該試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，紅松多酚對于機(jī)體巨噬細(xì)胞的代謝能力有促進(jìn)，對于劑量具有一定依賴性，且對劑量的反應(yīng)極敏感。

3結(jié)論

該試驗(yàn)通過MTT淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和大鼠巨噬細(xì)胞吞噬增殖反應(yīng)試驗(yàn)驗(yàn)證了紅松多酚對脾淋巴細(xì)胞和大鼠巨噬細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，紅松多酚對脾淋巴細(xì)胞具有顯著（P<0.05）促進(jìn)增殖的作用，且在0.1～0.4 mg/ml濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑-效關(guān)系。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體主要的免疫細(xì)胞，既可以直接吞噬外來異物及衰老的自身細(xì)胞，又可分泌白介素等細(xì)胞因子，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒、 抗腫瘤作用。試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，紅松多酚對于腹腔巨噬細(xì)胞具有增強(qiáng)其代謝能力的作用，且在0.3 mg/ml濃度以上，作用極顯著（P<0.01）。通過機(jī)體具有代表性的免疫細(xì)胞活性研究，初步表征了紅松多酚作為一種天然產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的機(jī)體免疫細(xì)胞活性促進(jìn)作用。

在藥物研究趨勢由化學(xué)合成藥物轉(zhuǎn)向天然藥物的今天，到目前為止研究者已對多種植物多酚進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、活性作用機(jī)理等研究。該試驗(yàn)的結(jié)論為紅松多酚作為良好的免疫促進(jìn)劑類保健品或藥物提供了科學(xué)依據(jù)，表明對紅松多酚的進(jìn)一步研究與開發(fā)具有科學(xué)和實(shí)用意義。

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