烏英 解云 古娜娜·對(duì)山別克 海力茜·陶爾大洪

摘要

[目的]研究庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮的最佳提取工藝。[方法]以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助提取，紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮的含量，以總黃酮含量為指標(biāo)，考察提取溫度、料液比、醇濃度、提取次數(shù)對(duì)庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮提出率的影響。對(duì)照品溶液和供試品溶液均在371 nm處有最大吸收，回歸方程為A=0.055 1C-0.007 5，r=0.999 8（0～16 μg/ml）。[結(jié)果]最終確定香梨果肉中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度75%，提取時(shí)間2 h，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)為1次；果皮中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度85%，提取時(shí)間1.0 h，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)為3次。庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮中平均總黃酮得率分別為1.79和5.12 mg/g。[結(jié)論]通過(guò)穩(wěn)定性、精密度和回收率試驗(yàn)檢驗(yàn)了該方法的可靠性和重現(xiàn)性。

關(guān)鍵詞 庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮；超聲提??；總黃酮

中圖分類號(hào) S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-09148-02

Study on Extraction Technology of Total Flavonoid from Pyrus bretschneideri Rehd Peel and Pulp by Ultrasonic Assisted Extraction

WU Ying， HAILIXI Taoerdahong et al

（College of Pharmacy， Xinjang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830011）

Abstract [Objective] To study the optimum extraction technique for total flavonoids from Pyrus bretschneideri Rehd fruit and peel. [Method] Ethanol as a solvent， using ultrasonic assisted extraction， UV-visible spectrophotometry was adopted to extract total flavonoids from fruit and peel of Pyrus bretschneideri Rehd. Effects of extraction temperature， solid-liquid ratio， ethanol concentration， extraction times on total flavonoids extraction yield were investigated. The reference solution and the test solution are maximum absorption at 371 nm. The regression equation is A=0.055 1C-0.007 5， r=0.999 8（0-16 μg/ml）. [Result] Eventually determine the optimum extraction conditions of total flavonoids in Pyrus bretschneideri Rehd pear flesh as follows： 75% ethanol concentration， extraction time 2 hours， extraction temperature 40 ℃， extraction times for 1 times. The best extraction conditions for total flavonoids in flesh： ethanol concentration 85%， 1.0 hours extraction time， extraction temperature 40 ℃， extraction times for 3 times. Pyrus bretschneideri Rehd in the pulp and peel， the average yield of flavonoid were 1.79 and 5.12 mg/g. [Conclusion] Through the stability， precision and recovery experiment examined the reliability and reproducibility of the method.

Key words Pyrus bretschneideri Rehd peel and pulp； Ultrasonic extraction； Total flavonoids

新疆庫(kù)爾勒香梨（Pyrus Bretschneideri Rehd ）為薔薇科梨屬中的白梨品種，其種植歷史已有1 400～2 000年^[1-2]，在新疆的種植面積廣、年產(chǎn)量高，果皮為黃綠色或略帶紅色，具有細(xì)嫩、多汁、甘甜、香味濃郁等特點(diǎn)，同時(shí)香梨富含果糖、蘋果酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分。現(xiàn)代藥理研究表明，香梨具有抗氧化、抗?jié)儭⒖寡?、?zhèn)咳祛痰平喘、抑菌、抗癌等功效^[3]。

目前已分離出的黃酮類化合物總數(shù)超過(guò)4 000個(gè)，廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域。黃酮類化合物可降低血管脆性及異常的通透性，可降血脂，降血壓，抑制血小板聚集及血栓的形成，有抗肝臟病毒、抗炎抗菌、抗癌防癌、抗氧化及抗衰老等作用^[4]。目前，對(duì)庫(kù)爾勒香梨的研究大多還停留在保鮮加工方面，還未見(jiàn)對(duì)庫(kù)爾勒香梨中黃酮物質(zhì)的提取、純化、應(yīng)用等的研究報(bào)道。筆者通過(guò)對(duì)超聲波輔助提取庫(kù)爾勒香梨中黃酮物質(zhì)的工藝進(jìn)行研究，確定提取溶劑與應(yīng)用的濃度、提取時(shí)間等參數(shù)，為庫(kù)爾勒香梨資源的充分開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)^[5-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對(duì)象。干燥、粉碎的新疆庫(kù)爾勒香梨的果皮和果肉。

1.1.2

儀器。UV9100D型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京菜伯泰科儀器有限公司；BS224型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司，SK5200HP超聲清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器。

1.1.3

試劑。 蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707），中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇（95%），天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純；5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液，均采用分析純，現(xiàn)配現(xiàn)用；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1

香梨黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。 黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁，分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液（0.08 mg/ml）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以不加對(duì)照品溶液的相應(yīng)溶液為空白對(duì)照，在371 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得校準(zhǔn)曲線A=0.055 1C-0.007 5，r=0.999 8，線性范圍在0～16 μg/ml，表明線性關(guān)系良好。

1.2.2

超聲波輔助提取總黃酮。 精密稱取1.0 g干燥的庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮適當(dāng)粉碎于錐形瓶中，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察不同提取溫度、不同含乙醇量、不同提取次數(shù)、不同提取時(shí)間在超聲波條件下對(duì)萃取庫(kù)爾勒香梨中總黃酮的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取主要影響因素及合適的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定香梨果肉和果皮中黃酮提取的最佳條件工藝條件。

1.2.3

測(cè)定液的制備。 準(zhǔn)確移取香梨果肉供試品溶液5.0 ml、香梨果皮供試品溶液3.0 ml，于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入60%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，得測(cè)定液備用。

1.2.4

最大吸收波長(zhǎng)的選擇。 準(zhǔn)確移取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”方法平行顯色，以試劑作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液及供試液均在371 nm處有最大吸收，故選擇371 nm處為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.5

樣品含量的測(cè)定。 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果取最佳提取條件，提取9份供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下依法測(cè)定各個(gè)溶液的吸光度，并根據(jù)回歸曲線方程計(jì)算總黃酮的濃度，推算出庫(kù)爾勒香梨果肉和果肉中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1

乙醇濃度對(duì)提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實(shí)各1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按提取時(shí)間為1 h，溫度60 ℃，提取次數(shù)為1次，乙醇濃度為40%、50%、65%、75%、85%、95%，進(jìn)行超聲波輔助萃取，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項(xiàng)下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm 處測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮含量。試驗(yàn)得出，香梨果肉中總黃酮的含量隨著乙醇濃度的增加而有所提高，但當(dāng)乙醇濃度>75%時(shí)，增加幅度很小。香梨果皮中總黃酮的含量當(dāng)乙醇濃度>85%時(shí)，增加幅度較小，所以確定了3個(gè)最佳料液比來(lái)進(jìn)行香梨黃酮提取的正交試驗(yàn)。

2.1.2

提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實(shí)1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按料液比1∶20 g/ml加入75%乙醇，溫度60 ℃，提取次數(shù)為1次，分別按提取時(shí)間30、60、90、120、180 min進(jìn)行回流，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項(xiàng)下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm 處測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮含量。根據(jù)得到的香梨黃酮含量可得知，香梨果肉中總黃酮隨時(shí)間的增長(zhǎng)提取量越高，超聲時(shí)間120 min后變化較小；香梨果皮中總黃酮提取量則在超聲時(shí)間90 min內(nèi)可以得到較高水平。

2.1.3

提取溫度對(duì)提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實(shí)1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按料液比1∶20 g/ml加入75%乙醇，提取次數(shù)為1次，分別按提取溫度20、40、60、80、100 ℃進(jìn)行回流，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項(xiàng)下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮含量。試驗(yàn)得出，香梨果肉和果皮中總黃酮提取量在40 ℃時(shí)含量最高。

2.1.4

提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實(shí)1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按料液比1∶20 g/ml加入75%乙醇，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間1 h，分別按提取次數(shù)為1、2、3、4、5次進(jìn)行回流，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項(xiàng)下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算總黃酮含量。由試驗(yàn)可知，總黃酮提取量隨著超聲次數(shù)的增加而提高，但超聲次數(shù)為3次時(shí)，總黃酮的提取量最高。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定了庫(kù)爾勒香梨果肉及果皮進(jìn)行正交試驗(yàn)的最佳因素水平，見(jiàn)表1、2。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，

各因素水平對(duì)香梨中果肉總黃酮的影響順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ）>提取時(shí)間（D）>提取次數(shù)（C）>溫度（B），即A₃D₃C₁B₁。結(jié)合方差分析，可知A、B、C、D因素的P均小于0.05，有顯著差異，果肉中各因素對(duì)試驗(yàn)的影響大小為：A>D>C>B，該結(jié)果與直觀分析的結(jié)果一致，所選條件成立：即乙醇濃度75%，提取時(shí)間2 h，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)為1次。

0.05，有顯著差異，果皮中各因素對(duì)試驗(yàn)的影響大小為：C>A>B>D，該結(jié)果與直觀分析的

結(jié)果一致，所選條件成立：乙醇濃度85%，提取時(shí)間1.0 h，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)為3次。

2.3 提取工藝驗(yàn)證

2.3.1

重現(xiàn)性試驗(yàn)。 精密稱取3份干燥的庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮，每份1.0 g，按最佳工藝提取，按“1.2.3”項(xiàng)下顯色處理后于371 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度， 求得果肉的RSD=0.02%（n=6），果皮的RSD=0.3%，表明所選工藝合理可行。

2.3.2

精密度試驗(yàn)。 精密稱取6份干燥的庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮，每份1.0 g，按最佳工藝提取，按“1.2.3”項(xiàng)下顯色處理后于371 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。求得果肉RSD=0.8%（n=6），果皮的RSD=0.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.3

加樣回收率試驗(yàn)。 精密稱取1.0 g 6份庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮至250 ml錐形瓶中，經(jīng)提取顯色處理濃縮后放置50 ml容量瓶，按低、中、高濃度分別加入蘆丁對(duì)照品1 ml（80 μg），2 ml（160 μg），3 ml（240 μg），稀釋至刻度。于371 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，果肉平均回收率為100.12%，RSD=1.3%（n=6），果皮平均回收率為98.5%，RSD=0.8%（n=6）。

2.3.4

穩(wěn)定性試驗(yàn)。 取供試品2 ml至25 ml容量瓶中按“1.2.3”項(xiàng)下顯色處理，分別于0、5、10、15、20、25、30 min測(cè)定吸光度，表明其顯色后30 min中基本穩(wěn)定，求得果肉RSD值為0.3%（n=6），果皮RSD值=0.5%（n=6），表明穩(wěn)定性良好。

3 討論

該試驗(yàn)采用超聲波輔助提取庫(kù)爾勒香梨中的總黃酮，考察了超聲波對(duì)庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮提取效果的影響。結(jié)果表明，超聲波對(duì)庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮的提取過(guò)程影響明顯，且通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了影響庫(kù)爾勒香梨果肉中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度75%，提取時(shí)間2 h，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)為1次。果皮中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度85%，提取時(shí)間1 h，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)為3次。庫(kù)爾勒香梨果肉和果皮中平均總黃酮得率分別為1.79和5.12 mg/g，該研究為開(kāi)發(fā)和利用香梨有效部位提供了理論依據(jù)。

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