蘇順清 田可敬 朱雁 戴新明 韓勇 張一鳴 宋娟

[摘要]目的：通過檢測聚丙烯酰胺水凝膠（PAHG）置入人體后乳房病變組織內(nèi)NF-κBp65、TNF-α表達，探討二者與PAHG注射隆乳術(shù)后乳腺病理改變的關(guān)系。方法：采用免疫組化染色法檢測20例正常乳腺組織，40例PAHG注射隆乳術(shù)后乳房病變組織中NF-κBp65、TNF-α 陽性表達細胞，比較分析兩組之間的差異。結(jié)果：①HE染色結(jié)果:光鏡下見切片中含大量均質(zhì)無定形凝膠樣注射物，PAHG周圍有不同程度纖維組織增生，伴或不伴纖維組織玻璃樣變性，并見炎性細胞浸潤；或局部呈異物巨細胞反應(yīng)，部分乳腺導管擴張；②免疫組化結(jié)果:NF-κBp65、TNF-α陽性細胞少見于正常乳腺組織中，而在實驗組近注射物周圍NF-KBp65、TNF-α陽性細胞數(shù)目增多，具有顯著統(tǒng)計學意義。但是NF-KBp65、TNF-α陽性細胞率與PAHG體內(nèi)存留的時間長短無明顯相關(guān)性。結(jié)論：NF-κBp65與 TNF-α在PAHG注射隆乳術(shù)后病變組織中的表達存在正性相關(guān)關(guān)系。NF-κBp65、TNF-α參與了聚丙烯酰胺水凝膠注射隆乳者乳房病變組織的免疫反應(yīng)過程，可能通過相互影響而共同誘導病變部位無菌性炎癥、纖維組織增生等反應(yīng)的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]聚丙烯酰胺水凝膠；細胞核因子-κB；腫瘤壞死因子-α；細胞因子；注射隆乳術(shù)

[中圖分類號]R655.8 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）09-0730-04

Exprssion of NF-κBp65 and TNF-α in human breast tissues injected with Polyacrylamide Hydrogel (PAHG) and clinical significance

SU Shun-qing,TIAN Ke-jing,ZHU Yan,DAI Xin-ming,HAN Yong,ZHANG Yi-ming,SONG Juan

(Department of Plastic Surgeoy,Tungwah Hospital of Dongguan Guangdong,Dongguan 523110,Guangdong,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the rate of NF-KBp65 positive cells and TNF-α positive cells in human breast tissues with Polyacrylamide Hydrogel (PAHG) Injection.By contrasting with control group we should guess the relationship between NF-KBp65,TNF-α positive with immuno-inflammation, fibroelastosis in human breast tissues with PAHG Injection.MethodsDetect the expression of NF-KBp65,TNF-α in 40 cases with PAHG Injection and 20 normal breast tissues by immuno-histochemistry sp,and analyzed all the samples combining with HE staining.Results①Masses of homogeneous amorphous polyacrylamide gel could be observed under light microscope. Around the PAHG,there were fibrous tissues proliferation with or without hyaline degeneration,and plenty of macrophages, monocytes, and histicytes but lymphocytes acuumulates surrounded.②Positive cell ofNF-κBp65 ,TNF-α were hardly found in normal breast tissues, while lots of them could be observed in human breast lesion tissues Injected with PAHG,especially obvious in fibrous connective tissue area (besides the PAHG).And the expression was not ratio with implantion time.ConclusionNF-κBp65 and TNF-α play an important part in immuo-inflammatary reactions of breast tissues with PAHG Injection.Which induce fibrous tissues proliferation and aseptic inflamation in lesion area.Meanwhile,NF-κBp65 and TNF-α has Pearson positive relevance in the changes.

Key words:Ployacrylamide Hydrogel(PAHG); NF-κB; TNF-α; cytokine;injective augmentation mammolplasty

聚丙烯酰胺水凝膠（PAHG）曾一度被視為良好的軟組織填充材料，在東歐及亞洲等地區(qū)被廣泛應(yīng)用。隨著PAHG注射患者增多及注射時限推移，PAHG注射隆乳術(shù)后并發(fā)癥報道逐漸增多[1-2]。雖然我國政府早在2006年即禁止使用PAHG進行注射隆乳，但是已完成注射治療的數(shù)十萬病例術(shù)后并發(fā)癥逐漸凸顯出來。細胞核因子-κB（NF-κB）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與多種炎癥及腫瘤性疾病的發(fā)生[3-4]。PAHG長期置入人體后可引發(fā)乳腺及其周圍組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)及炎性細胞增殖，導致發(fā)生一系列的并發(fā)癥的發(fā)生[5-8]。本研究主要采用免疫組化染色的方法檢測PAHG注射隆乳術(shù)后乳房病變組織中NF-κBp65及TNF-α的表達，探討NF-κBp65、TNF-α與PAHG注射隆乳術(shù)乳腺組織病理改變的關(guān)系。

1資料和方法

1.1 一般資料：收集2006年1月至2011年1月因“雙側(cè)聚丙烯酰胺注射隆乳術(shù)后”病例46例?；颊吣挲g24～41歲，平均31.8歲，隆乳術(shù)后時間為1～10年不等，平均5.3年。所選病例中乳房硬結(jié)或包塊者40例；合并注射物移位、雙乳變形或不對稱者6例；PAHG注射合并硅膠假體置入隆乳者2例；PAHG注射合并哺乳期或產(chǎn)褥期乳腺炎者4例。經(jīng)過篩選排除6例，最終病例40例。

1.2 研究對象分組

1.2.1 實驗組（40例）：依據(jù)PAHG聚集部位分2組：①A組：囊壁組 （38例），包裹PAHG周圍形成的纖維包膜組織，②B組：非囊壁組（34例）：囊壁外周受累乳腺或肌肉組織。依據(jù)PAHG注射隆乳時限（即PAHG體內(nèi)存留時間）分3組：①Y1組(15例)：注射時限4年及以內(nèi)；②Y2組(15例)：注射年限4～7年；③Y3組(10例)：注射時間7年以上。

1.2.2 對照組（20例）：收集同期于我院乳腺外科門診及住院患者中行乳房診斷性穿刺病理結(jié)果證實“正常乳腺組織”20例作為對照。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑：兔抗TNF-α多克隆抗體（抗體工作液濃度為1:100）購買自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，鼠抗NF-κBp65單克隆抗體（抗體工作液濃度為1:300）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP免疫組化檢測試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3.2 取材及切片制備：根據(jù)患者具體情況采用乳暈或乳房下皺襞切口，將切除的包裹PAHG囊壁組織及其周圍受累乳腺或/和肌肉組織置于l0%甲醛固定液中固定，常規(guī)石蠟包埋、儲存。收集所選病例（40例）蠟塊標本共52例及對照組蠟塊20例，每例各做4μm連續(xù)切片3張，分別用于進行HE染色及TNF-α、NF-κBp65免疫組化染色。

1.3.3 實驗方法：免疫組化染色采用SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法）。

1.3.4 觀察的指標及陽性細胞判斷標準：TNF-α陽性細胞：免疫組化染色后細胞質(zhì)呈棕黃色或褐色著色的細胞；NF-κBp65陽性細胞，經(jīng)免疫組化染色后細胞質(zhì)和/或細胞核呈棕黃色或褐色著色的細胞。每張切片在高倍顯微鏡下隨機選擇10個無重疊視野，計算每個視野中陽性細胞百分比，取平均值作為該標本的陽性細胞表達率。

1.3.5 統(tǒng)計學方法：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。對不同分組中TNF-α及NF-κBp65細胞陽性表達率之間的差異采用t檢驗及Kruskal-Wallis H檢驗（檢驗水準α=0.05）進行分析；TNF-α及NF-κBp65在病變組織內(nèi)的表達之間的關(guān)系采用pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1 常規(guī)HE染色結(jié)果：光學顯微鏡下見切片中含大量淡藍色或淡紫紅色均質(zhì)無定形聚丙烯酰胺水凝膠物，圍繞PAHG周圍有不同程度纖維組織增生，伴或不伴纖維組織玻璃樣變性，并見巨噬細胞、多核巨細胞、少許中性粒細胞浸潤，但淋巴細胞少見；局部呈異物巨細胞反應(yīng)并/或形成異物肉芽腫（見圖1）；腺體、肌肉、脂肪組織間亦可見藍染無定形注射物，部分乳腺導管擴張，乳腺小葉輕度或無明顯增生性改變；部分病例可見胸大肌細胞發(fā)生玻璃樣變性，甚至萎縮改變（見圖2）。

2.2 免疫組化染色結(jié)果：實驗中所得數(shù)據(jù)（陽性細胞率）均采用x±s表示，界值P<0.05，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，對不同組病例中的TNF-α、NF-κBp65陽性表達率差異進行t檢驗及Kruskal-Wallis H檢驗分析。對PAHG注射組病變組織中TNF-α陽性表達與NF-ΚBP65陽性表達兩者之間的關(guān)系采用pearson相關(guān)分析。

2.2.1 PAHG注射隆乳術(shù)后病變組織中NF-ΚBp65的表達（見表1～2）：NF-ΚBp65在PAHG注射組（陽性細胞率54.00%±19.59%）表達于成纖維或纖維細胞、異物巨細胞胞漿中，有的乳腺腺泡上皮細胞、導管上皮細胞、肌細胞胞漿內(nèi)也可見棕黃色或黃色顆粒物質(zhì)，甚至一些細胞胞核也可呈陽性改變（見圖3～4）。

2.2.2 PAHG注射隆乳術(shù)后病變組織中TNF-α的表達情況（見表1～2）：TNF-α陽性細胞呈黃色或棕黃色著色，在PAHG注射組均可見TNF-α陽性細胞，主要表達于異物巨細胞、巨噬細胞的胞漿，少量成纖維細胞胞漿也可見棕黃色顆粒；而在正常對照組TNF-α陽性細胞較少見（見圖5～6）。

2.2.3PAHG注射隆乳術(shù)后病變組織內(nèi)TNF-α表達與NF-ΚBP65表達關(guān)系：對PAHG注射組病變組織中TNF-α陽性表達與NF-ΚBP65陽性表達兩者之間的關(guān)系采用pearson相關(guān)分析，r=0.294，兩者之間存在正性相關(guān)關(guān)系。

3討論

PAHG作為軟組織填充材料進入體內(nèi)可引起機體細胞免疫及體液免疫的改變；NF-κB 是一種重要的細胞因子上游調(diào)控因子，當細胞受到細胞外信號刺激時，NF-κB 便迅速從細胞質(zhì)移位到細胞核，和基因的啟動子結(jié)合，促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、自由基損傷等病理生理過程[9]。TNF-α則是一重要的促炎癥細胞因子，可誘導細胞凋亡、蛋白激酶、NF-κB等的激活，參與細胞死亡、代謝、炎癥反應(yīng)和纖維組織增生等生物反應(yīng)[3]。

3.1 PAHG注射隆乳術(shù)后組織病理改變

3.1.1 PAHG注射隆乳術(shù)后臨床觀察：本組病例均有不同程度的乳房包塊或硬結(jié)，可能與PAHG注射后不被人體組織吸收，或重力作用促使PAHG聚集、移動有關(guān)；加上術(shù)后注射部位規(guī)律或不規(guī)律的按摩和肌肉活動，會使得PAHG向周圍組織浸潤，甚至侵犯乳腺組織或胸大肌，以分散的團塊形式分布于乳腺內(nèi)、皮下或超出乳房以外的區(qū)域，導致乳房形態(tài)異常。注射PAHG隆乳術(shù)后，手術(shù)中取出的游離PAHG顆粒，呈淡黃色半透明顆粒狀外觀；于PAHG周圍見菲薄的纖維組織包膜。PAHG作為異物，刺激機體產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)，形成的纖維包膜組織較薄，對外部各種作用力（重力、壓力等）耐受性差，這也導致PAHG易于向周圍組織間隙中擴散。分散在脂肪、腺體或者胸大肌組織中，更有甚者受累肌肉或腺體組織變性，呈黃白色透明外觀，失去正常組織彈性。

3.1.2 PAHG注射隆乳術(shù)后乳腺組織病理學改變：PAHG注射后早期細胞增生明顯，圍繞PAHG周圍有大量的多核異物巨細胞、大量的增生的組織細胞與成纖維細胞。發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺水凝膠大量分散于乳腺、脂肪及橫紋肌內(nèi)，伴有大量多核巨細胞及明顯的異物肉芽腫，成纖維細胞增生，部分橫紋肌失去正常結(jié)構(gòu)甚至變性消失。本組術(shù)中乳房病變組織進行HE染色檢查發(fā)現(xiàn)：PAHG注射術(shù)后患者病理切片光鏡下見大片藍染均質(zhì)無定形聚丙烯酰胺水凝膠，周圍有不同程度的纖維組織增生，越靠近注射物部位纖維增生、免疫炎癥反應(yīng)越重，并伴有巨噬細胞、少量的中性粒細胞等炎性細胞浸潤；部分區(qū)域還可見異物巨細胞反應(yīng)并形成肉芽腫或隆乳劑性假瘤改變；而且上述乳房局部免疫炎癥反應(yīng)隨PAHG在體內(nèi)存留而持續(xù)存在。

3.2PAHG注射隆乳術(shù)后乳腺組織局部免疫反應(yīng)：在本組正常乳腺中也可見少量NF-κBp65表達，主要位于乳腺間質(zhì)細胞或單核-巨噬細胞胞漿內(nèi)，這與相關(guān)文獻報道結(jié)果一致[9]。但在聚丙烯酰胺水凝膠注射隆胸術(shù)后病變組織NF-κBp65表達明顯增加，且注射物周圍囊性包膜組織NF-κBp65陽性細胞增加更明顯，并出現(xiàn)纖維增生及炎性細胞、異物巨細胞的浸潤。NF-κBp65陽性細胞率在PAHG在體內(nèi)存留時間分組中比較無明顯差異，提示聚丙烯酰胺水凝膠注入人體后作為異物長期刺激注射部位發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)。在PAHG隆乳術(shù)后的乳腺組織中TNF-α陽性細胞也明顯增多，同樣在注射物周圍囊性包膜組織內(nèi)聚集明顯，與非包膜組織（乳腺及肌肉組織）內(nèi)陽性表達細胞率比較有顯著統(tǒng)計學意義；但在正常乳腺中少見TNF-α陽性細胞的表達。

腫瘤壞死因子-α是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，是機體炎癥與免疫的重要介質(zhì)。TNF-α在體內(nèi)過量產(chǎn)生和釋放時則會破壞機體的免疫平衡 ,并與其它炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷[10]。細胞核因子-κB 是一種重要的細胞因子上游的調(diào)控因子，核因子-κB(NF-κB)是一類主要參與炎性因子表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，與某些基因啟動子及增強子區(qū)的序列結(jié)合,啟動或增強這些基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、自由基損傷等多種生物學效應(yīng)[4]。

本研究結(jié)果顯示聚丙烯酰胺水凝膠注射組乳腺病變組織內(nèi)NF-κBp65、TNF-α陽性表達細胞率明顯高于對照組正常乳腺組織，聚丙烯酰胺水凝膠作為異物引起機體較劇烈免疫炎癥反應(yīng)，而NF-κBp65、TNF-α參與了這種乳腺局部免疫炎癥反應(yīng)及纖維組織增生，且兩種細胞因子在反應(yīng)過程中可能存在相互作用，共同促使注射物周圍囊壁組織、腫塊或炎性反應(yīng)的發(fā)生等。聚丙烯酰胺水凝膠注射后NF-κBp65、TNF-α的相互作用，刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而產(chǎn)生一系列并發(fā)癥。

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[收稿日期]2014-03-15[修回日期]2014-04-30

編輯/張惠娟