崔娟娟 欒雨時

摘 要：miRNA（microRNA）是一類長約22nt的非編碼小RNA分子，參與植物生長發(fā)育和脅迫響應等過程。近年來，通過生物學實驗和生物信息學預測兩種方法，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些響應病毒、真菌和共生真菌脅迫的番茄miRNA。這些miRNA的研究以及amiRNA（artificial miRNA）技術的應用，將為番茄乃至其他植物病害的防治提供新的契機。

關鍵詞：番茄；生物脅迫：miRNA：amiRNA

中圖分類號：Q74

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-0533-06

miRNA是一類在真核生物中普遍存在的非編碼小RNA分子，在轉錄后水平調控真核生物的基因表達。在細胞核中，miRNA基因轉錄生成pri-miRNA，經DCL1（dicer-like l）加工后生成具有發(fā)火結構的pre-miRNA，它被轉運出細胞核后形miRNA/miRNA A*，雙鏈解旋形成成熟的miR-NA.隨后miRNA與AGO（Argonaute）等蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合物RISC（RNA -in-duced silengcing complex），從而在轉錄后水平通過翻譯阻遏或降解機制發(fā)揮調控作用。miRNA的種類繁多、分布廣泛，于轉錄后水平發(fā)揮關鍵調節(jié)作用，在多種生物中得到廣泛研究，截至2013年6月，miRBase Release 20（http：//www.mirbase.org/）中已經收錄了24 521條miRNA成熟序列，主要集中在人、小鼠、擬南芥、水稻等模式生物中，而番茄中儀收錄了46條，miRNA不僅調控番茄的根、莖、葉及果實發(fā)育，還參與番茄的新陳代謝、激素途徑、牛物和非生物脅迫響應等過程近年來，越來越多的研究集中于挖掘并探究生物脅迫相關的番茄miRNA。生物脅迫下，每個番茄miRNA的表達模式都存在差異，它們的靶基因變化趨勢與 miRNA的變化趨勢有時相反，有時相同。深入研究這些miRNA的作用機制及功能將為植物病害防治提供新的思路。本文概述了挖掘生物脅迫相關miRNA的方法，系統(tǒng)地闡述了miRNA在番茄響應病毒和真菌脅迫過程中所發(fā)生的變化，討論了amiRNA在提高番茄抗病性中的最新研究進展，并對miRNA在植物抗病研究中的應用進行了展望。

1 生物脅迫相關miRNA的挖掘

生物學實驗和生物信息學預測是挖掘miR-NA的兩種主要方法。生物學實驗包括基因芯片和高通量測序兩種技術?；蛐酒夹g是將已知miRNA固定在芯片介質上，依據(jù)堿基互補原理挖掘miRNA的一種方法。由于該方法具有快速、準確和成本較低等優(yōu)點，因此，在挖掘生物脅迫相關miRNA時被廣泛應用。如Jin等用芯片技術檢測到了3個與灰霉病菌脅迫相關的番茄miRNA。高通量測序技術主要是通過構建小RNA文庫，根據(jù)堿基序列長度、前體結構、最小自由能等參數(shù)進行篩選，獲得候選miRNA的一種手段。該技術具有準確性、可靠性和通量高等優(yōu)點，也是挖掘生物脅迫相關miRNA的常規(guī)手段之一。如Chen等用高通量測序技術檢測到了33個與病原菌脅迫密切相關的楊樹miRNA。隨著生物信息技術的飛速發(fā)展和各物種基因組信息的逐步完善，高效、經濟的牛物信息學控掘也成了發(fā)現(xiàn)生物脅迫miRNA的重要手段。生物信息學預測是依據(jù)miRNA的成熟體及前體特征，在EST、GSS及基因組序列中預測潛在的miRNA的一種方法。此方法已在馬鈴薯、糜子、桃等物種中得到成功應用。結合miRNA啟動子、靶基因功能分析，能夠預測候選miRNA的功能。通過生物信息學手段很有可能找到和生物脅迫密切相關的miRNA，但由于缺乏驗證，更多的研究有待深入。生物學實驗和生物信息學預測兩種方法各有優(yōu)劣，越來越多的研究已將二者結合，這也將成為未來發(fā)現(xiàn)關鍵病害相關miRNA的強大手段。

2 番茄miRNA與生物脅迫

番茄在生長過程中會遇到多種牛物脅迫，因此.它也是研究植物與微生物互作的模式材料之一。 隨著基因芯片、高通量測序和生物信息學預洲等技術的發(fā)展，越來越多響應生物脅迫的番茄miRNA被發(fā)現(xiàn)，它們的表達在番茄響應病毒、真菌和共生真菌的過程中發(fā)生著不同程度的變化，現(xiàn)歸納于表1。

2.1 番茄miRNA與CMV和TAV

2.1.1 番茄miRNA與CMV和TAV脅迫

CMV （cucumher mosaic virus）是寄主范圍最廣、影響最大的植物病原物之一。Lang等用芯片技術發(fā)現(xiàn)了12個番茄miRNA與CMV脅迫應答相關。TAV （tomato aspermv virus）與CMV的基因組同源性很高，二者共屬黃瓜花葉病毒屬，但有不同的寄主和植株感病癥狀。為探究番茄miRNA如何響應CMV和TAV脅迫，F(xiàn)eng等選擇了miR159、miR162、miR164、miR165/166、miR-167、m1R168和m1R17l共7個與番茄生長發(fā)育、激素信號轉導途徑和miRNA自身形成相關的miRNA進行研究，發(fā)現(xiàn)上述兩種病毒處理后，這7個miRNA的表達差異明顯，暗示這些miRNA可能參與番茄響應CMV和TAV的脅迫過程。

為深入探索其內在機制，F(xiàn)eng等進一步研究了CMV和TAV脅迫下番茄miRNA在不同處理時間后的表達特性，結果發(fā)現(xiàn)它們的表達變化各不相同。miR159、miR162、miR168和miR171在脅迫處理后異常表達，而miR164、miR165/166和miR167的變化甚微。在第10 d時CMV處理組較TAV處理組的miRNA有更高的表達量，第20d時兩者相差不多，第30 d時TAV處理組表達量更高。此外，miR168在CMV處理后第10 d的表達量是對照的15.2倍，miR162在TAV處理后第30 d的表達量是對照的4.5倍。

miRNA在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調節(jié)作用，研究表明，生物脅迫處理后參與番茄生長發(fā)育的miRNA異常表達，這一現(xiàn)象與生物脅迫后番茄葉、果實和根等組織的病變有關。Feng等用CMV和TAV處理番茄的花和果實，發(fā)現(xiàn)在不同組織和協(xié)迫時期，與發(fā)育相關的miRNA異常表達。如，miR159主要在蕾期、開花期及果實發(fā)育早期；miR160在果實成熟期；miR167在開花及果實直徑達1～5 mm的時期；miR172在蕾期及開花期。這些miRNA的異常表達可能誘發(fā)了脅迫處理后花和果實的病變。

基于以上進展，F(xiàn)eng等又研究了 CMV和TAV脅迫下，l1個番茄miRNA在根和莖中的表達特性。結果發(fā)現(xiàn)它們的表達特性各不相同。經CMV-Fny-satT1（加重病癥的CMV）和TAV處理21 d，番茄莖部會分別出現(xiàn)中空和纖維化現(xiàn)象。其中，兩種脅迫處理后miR156都表達異常，而過表達miR156a的轉基因番茄會出現(xiàn)莖髓消失，與CMV和TAV誘發(fā)的莖中空及纖維化現(xiàn)象類似。因此，miR156的異常表達可能導致了番茄莖部的病變此外，經CMV和TAV脅迫處理的番茄，側根數(shù)明顯減少，而ARF （auxin response factor）與植物的側根發(fā)育相關，研究中以ARF為靶基因的miR160、miR164和miR167均發(fā)生了異常表達的現(xiàn)象，說明它們誘發(fā)了番茄側根數(shù)量的減少。

2.1.2

番茄miRNA與CMV的沉默抑制子

CMV的基因組編碼5個ORF，包括la、2a、2b、3a和3 b：其中，2b是最重要的致病蛋白，也是CMV的沉默抑制子，通過抑制沉默途徑的關鍵因子AGO蛋白活性，在病毒逃避植物免疫的過程中發(fā)揮著重要作用。Feng等的研究表明，miR168及其靶基因AGO在CMV和TAV處理番茄后，均出現(xiàn)上調表達的矛盾現(xiàn)象。然而在2h突變病毒株的處理下，相應的番茄miRNA的表達量幾乎沒有發(fā)生變化。說明2b在干擾番茄利用miRNA抵御CMV的過程中發(fā)揮了重要作用。其機制可能是2h抑制了AGO對miRNA靶基因的切割活性，導致靶基因大量累積，最終出現(xiàn)CMV和TAV脅迫下番茄miRNA及靶基因的表達整體上調的矛盾現(xiàn)象。

2.1.3 番茄miRNA與CMV的衛(wèi)星RNA

一些CMV株系能夠用病毒殼體包裹小的自剪接RNA分子，形成satRNA（satetlite RNA），它必須依賴于輔助病毒進行侵染和復制。satRNA在CMV中以不同的突變體形式存在，可以改變植物病癥。據(jù)Feng等報道，在CMV和TAV脅迫下，11個miRNA及相應的靶基因發(fā)生了不同程度的異常表達一然而，當向CMV導入減弱病癥的satRNA時，這些miRNA的變化不明顯。與此相反，當導入攜帶有加重病癥的satRNA時，番茄的miRNA又發(fā)生異常表達的現(xiàn)象。該研究暗示了satRNA在CMV 干擾番茄miRNA調控中的復雜作用。

2.2 番茄miRNA與ToLCV

ToLCV（ tomato leaf curl virus）是一類雙生病毒，該類病毒變異速度快，寄主范圍廣，常給熱帶或亞熱帶國家和地區(qū)的農業(yè)生產帶來巨大影響。Naqvi等用芯片技術檢測到13個與ToLCNDV（ tomato leaf curl new delhi virus）相關的番茄miRNA，它們的靶基因表達趨勢與之相反。研究還發(fā)現(xiàn)，經ToLCNDV處理后，多種不同番茄資源材料中的miR159/319和miR172異常表達，且這三者與葉片發(fā)育密切相關，因此，推測它們在ToLCNDV脅迫后的異常表達可能導致了番茄卷葉癥狀。

ToLCV以單分子DNA-A或兩分子DNA-A、DNA-B閉環(huán)狀ssDNiA的方式存在。DNA-A的正義鏈編碼AV1和AV2，互補鏈編碼AC1、AC2、AC3、AC4，共有6個ORF。 AC1編碼復制相關蛋白，AC2編碼轉錄激活蛋白，AC3編碼復制增強子蛋白，AC4編碼癥狀表達決定性的蛋白。DNA-B編碼BC1和BV1，前者促進病毒在細胞間的傳播，后者使新形成的病毒基因轉移到細胞質。為研究番茄的miRNA是否能夠靶向病毒基因，從而抑制病毒增殖，Naqvi等用生物信息學方法預測到9個番茄miR/miR*序列與ToLCV的6個不同的ORF有很高的序列匹配性。其中miR164a、miR169b*、m1R169d和miR171*靶向ToLCV的外殼蛋白14 V1基因，miR164和miRl69b*在，AVI處有交叉結合位點。4個miR/miR*靶位點都相對較近，它們可能協(xié)同作用，導致高效的AV1靶基因沉默。研究還發(fā)現(xiàn)一些miR*，可能也參與了抑制病毒生長的過程，如miR156*靶向AC2、AC3，miR172*靶向AV2等，這些均揭示了miR*在植物抗病中的新角色。

2.3 番茄miRNA與灰霉菌

灰霉病是導致番茄莖腐爛的重要病害之一，常造成栽培番茄的減產。Jin等用基因芯片技術檢測到番茄miR169、m1R160和miR171a與灰霉病菌脅迫相關。在病菌處理后12 h，miR169上調表達，miR160和miR171a下調表達、其中，miR169的靶基因下調表達，而miR171a和miR160的靶基因均上調表達。啟動子分析表明，miR169的啟動子區(qū)域存在一個與許多植物基因病原誘導相關的順式作用元件-Box-Wl，該區(qū)域也是WRKY轉錄因子家族的結合位點，參與創(chuàng)傷響應基因的表達調控，且miR169的啟動子區(qū)存在創(chuàng)傷響應元件WUN-motif暗示miR169可能受控于轉錄因子，參與了創(chuàng)傷響應途徑。

2.4 番茄miRNA與叢枝菌根

叢枝菌根是叢枝菌根真菌與植物根部組織長期進化形成的共生菌根，它在促進植物生長和抵御不良環(huán)境中發(fā)揮著積極作用，是與農業(yè)生產關系最為密切的菌根之一。Gu等用基因芯片技術研究了番茄miRNA與叢枝菌根的關系。發(fā)現(xiàn)miR395、miR779.1、miR840和miR867在有叢枝菌根的番茄葉片中特異性表達，miR158、miR862-3p、miR319、miR394和miR399在有從枝菌根的番茄根部異常表達這些都暗示了miRNA在番茄與叢枝真菌共生過程中發(fā)揮著調節(jié)作用。

2.5 其他

Shivaprasad等通過分析番茄小RNA數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)番茄中存在miRNA介導的級聯(lián)式訓控，該調控途徑參與番茄抗病過程。啟動級聯(lián)調控的miRNA超家族包括miR482和miR2118等。它們廣泛存在于各種植物中。雖然miR482和miR2118家族成員之間序列差異大，但都是以包括NBS（NUCLEOTIDE-BINDING SITE）和LRR（ leucine-rich re-peat）在內的植物抗病基因家族為靶基因。其中，miR482通過降解NBS-LRR而引發(fā)級聯(lián)反應，在番茄抗病過程中發(fā)揮重要作用。同時，Li等預測到miR482a、miR482b、miR482c和 miR482d在番茄染色體上成簇存在，暗示了它們可能協(xié)同作用響應生物脅迫。而miR6022、miR6023、miR6024、miR6026和miR6027的靶基因多為番茄抗病基因，更進一步表明該miRNA家族在番茄響應生物脅迫中的重要作用。以上與生物脅迫相關的miRNA，都可被選作候選miRNA分子，進行深入的致病分子機制研究和功能分析。

3 amiRNA在番茄抗病中的應用

隨著miRNA的生成及作用機理研究的日漸深入，針對病原物基因設計人工miRNA的技術也隨之產生。miRNA是為了在生物體內控制某一個或多個基因的表達，根據(jù)天然miRNA結構特點和作用機制，通過人工設計構建、轉導并在生物體內表達而產生的目的miRNA，是調控靶基因表達的一項新的生物技術。Qu等利用miR171a的前體骨架，構建了以CMV沉默抑制子26為靶基因的amjRNA，導入后的轉基因煙草能夠有效抵御CMV，并且amiRNA表達量越高，轉叢因煙草對CMV的抗性越強。Niu等利用擬南芥miR159前體骨架成功地構建廠兩個分別以TYMV（ turnip yellow mosaic virus）和TuMV （turnip mo-saic- virus）沉默抑制子為靶基因的amiRNA，兩組轉基因植株都能夠有效抵御TYMV和TuMV的危害。該研究還發(fā)現(xiàn)，同時導入這兩個amiRNA的轉茵番茄對TYMV和TuMV有100%的抗性。這些以病毒關鍵致病基因為靶基因的amiRNA都可以和正常miRNA一樣在植物體內產生、成熟并發(fā)揮作用，使植物獲得抗病特性，并且穩(wěn)定遺傳給子代。Zhang等利用南芥miR159前體骨架，設計了兩個amiRNA構件，一個是amiR-2a/b：5-UUGGAGUUCGACGUUUGUCAU -3'，靶向CMV 2α （RNA依賴的RNA聚合酶蛋白基因）和2b疊基基因，另一個amiR一3UTR：5 -UGAC-CAUUUUAGCCGUAAGCU-3，靶向CMV基因的保守區(qū)域3'UTR。將這兩個amiRNA導人番茄，得到了能夠抵抗CMV、TMV （tobacco mosaic virus）和TYLCV （ tomato yellow leaf curl virus）等病毒的植株，并且靶向2α和2b的amiRNA，對CMV抑制效果達85.7%～100%。另外，Vu等也在番茄中成功地構建并導入了兩個針對ToLCNDV的amiRNA載體。其中，amiR-AVl-3靶向ToLCV的AV1基因，amiR -AV1一l靶向AV1和AV2重疊基因。導入amiR-AVl-l的T2代轉基因番茄對ToLCNDV的抗性達80%。amiRNA技術通過創(chuàng)造新的非天然miRNA，為植物病害治理提供了新的契機，然而由于miRNA的生成和作用機制尚未完全清楚，仍存在一些不確定因素，有待更多的實驗研究。

4 展望

miRNA作為一種普遍存在于生物體內的關鍵調控因子，不僅參與植物的生長發(fā)育，還與響應生物脅迫密切相關。番茄是研究植物與微生物百作的模式植物之一。從番茄中挖掘與生物脅迫相關的miRNA以及在植物病害治理上應用amiRNA技術已經取得了重大突破，這些成果對番茄抗病研究具有重要意義。結合基因工程技術把天然miRNA或miRNA導入不同品種的番茄中，不但能夠深入了解生物脅迫相關miRNA的分子作用機制，還可獲得抗病新種質，經過高效種植技術從而提高番茄的經濟效益。同叫，番茄生物脅迫相關miRNA的挖掘也會對其他植物的相關研究起到積極的推動作用。相信在不久的將來，隨著人們對miRNA及amiRNA的進一步子解和掌握，將為植物病害防治提供一條全新的路線。