李正發(fā) 董 婷 歐陽紅梅 張 芹 蔣雅先 朱紅艷 辜學忠 沈曉梅 楊同華 賴 洵 史克倩 楊艷梅 聞 艷

摘要：采用流式細胞術(shù)雙標法檢測擬診免疫相關(guān)性全血細胞減少癥患者（A組）、非免疫相關(guān)性惡性血液病患者（B組）及正常人（正常對照組）的骨髓單個核細胞結(jié)合的自身抗體.同時檢測B組、確診免疫相關(guān)性全血細胞減少癥（C組）及正常對照組外周血B淋巴細胞及CD5+B淋巴細胞比率；A組中16例骨髓造血細胞自身抗體陽性，陽性率88.88%；B組1例骨髓造血細胞自身抗體陽性，陽性率9.09%。C組外周血B淋巴細胞CD5+B淋巴細胞比率顯著高于B組及正常對照（P均<0.05），而正常對照組外周血B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞顯著高于B組（P均<0.05 ）；TRP患者骨髓單個核細胞自身抗體表達顯著增高，B淋巴細胞總數(shù)及CD5+B淋巴細胞數(shù)量顯著增高可能是IRP發(fā)病的重要因素之一；利用流式細胞術(shù)檢測骨髓造血細胞自身抗體及B淋巴細胞數(shù)可以為IRP提供科學可靠的依據(jù).優(yōu)于骨髓Coombs實驗

關(guān)鍵詞：全血細胞減少：免疫相關(guān)性；自身抗體；流式細胞術(shù)：B淋巴細胞：CD5+B淋巴細胞

中圖分類號：R446.11+3

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）05-0418-05

免疫相關(guān)性全血細胞減少癥（immuno-relatedpancytopenia，IRP）是由于T淋巴細胞調(diào)控失衡導(dǎo)致B淋巴細胞數(shù)量、亞群、功能異常，進而B淋巴細胞產(chǎn)生自身抗體，最終引起血細胞減少癥候群。作為臨床多個學科易見的疾病，其與再生障礙性貧血（aplastic anemla，AA）、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）、陣發(fā)性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria， PNH）、慢性病性貧血（anef11ia of chronic disease，ACD）等骨髓衰竭性疾病不易區(qū)分，容易混淆，危害性大，治療難以著手，是困擾臨床醫(yī)師的一大難題。

自2001年IRP由邵綜鴻等提出以來，對于IRP的實驗室診斷研究尤為引起關(guān)注。目前IRP患者自身抗體的實驗室檢測手段有骨髓單個核細胞Coambs試驗、骨髓細胞抗體放散試驗、流式細胞術(shù)雙標法，其中敏感性最高的屬流式細胞術(shù)雙標法。近期有研究提出，IRP患者自身抗體的產(chǎn)生可能與骨髓B淋巴細胞及其亞群數(shù)量異常有關(guān)。本文在證實流式細胞術(shù)雙標法檢測患者自身抗體敏感性的同時，摸索最佳檢測條件以便日后開展于臨床檢驗。并利用流式細胞術(shù)檢測正常人、非免疫系統(tǒng)的惡性血液病患者及IRP患者外周血B淋巴細胞及CD5+B淋巴細胞比率，比較三類患者的差異，為IRP的鑒別診斷提供更多的鑒別參考，而且還有利于制定更有效的治療策略。

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實驗部分

1.1 材料

1.1.1 病例

29例患者均取自于云南省第一人民醫(yī)院血液科初治住院病人，其中18例按照文獻[4]標準擬診為IRP患者，男11例、女7例，年齡17—56歲，即未明確診斷組（A組）；另11例為明確診斷非免疫相關(guān)陛惡性m液病組（B組），男5例、女6例，年齡17-48歲，分別診斷為再生障礙性貧血3例、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿4例及骨髓曾生異常綜合征4例，均符合國內(nèi)診斷標準；A組經(jīng)確診為IRP后設(shè)為C組；另設(shè)正常對照22例，其中男11例、女11例，年齡18～56歲。

l.1.2 試劑與儀器

異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人IgG、IgM、IgA、CD5、CD3單克隆抗體，藻紅蛋白（PE））標記的鼠抗人CD34、CD15、CD19、CD235、CD4單克隆抗體以及它們各自的同型對照均購自于美國Beckman Coulter公司，流式細胞儀型號FM500MPL為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 Facs雙標法檢測骨髓造血細胞自身抗體

取9根檢測管分成3組均加入肝素抗凝的骨髓液100μL，3組分別加入PE熒光標記的鼠抗人CD15或PE標記的鼠抗人CD34、PE標記的鼠抗人Glyco-A單克隆抗體20 μL，每組內(nèi)再分別加入FITC標記的鼠抗人IgG、IgM、IgA。常溫避光孵育20 min后，加入紅細胞裂解液，混勻后室溫孵育10 min，最后加入適量PBS液混勻。同型對照加入鼠抗人IgGl單克隆抗體-PE、鼠抗人IgG2單克隆抗體-FITC各20 μL，按同樣方法操作。處理后標本上流式細胞儀測定骨髓單個核細胞（CDl5+細胞、CD34+細胞、GlycoA+細胞）表面自身抗體IgG 、lgM、IgA的結(jié)合率。每個樣品收集15 000個細胞。

1.2.2 檢測外周血總B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞比率

取1根檢測管，加入20 μL PE標記的鼠抗人CD19單克隆抗體、20μL EITC標記的鼠抗人CD5單克隆抗體，再加入100 μL新鮮外周血，混勻，室溫避光孵育20 min，加入紅細胞裂解液，混勻再孵育10 min，加入適量PBS液混勻。同型對照管加入FITC標記的鼠抗人LgG2單克隆抗體、PE標記的鼠抗人IgCl單克隆抗體各20μL，其他均按同樣方法操作。處理好樣品用流式細胞儀分別測定CD5+CD19+、CD19+細胞的表達率。每個樣本收集15 000個細胞。

1.2.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS19.0數(shù)據(jù)軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，對正態(tài)分布的數(shù)據(jù)變量以x±s表示，用t檢驗比較兩組間是否有顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 骨髓單個核細胞表面相關(guān)抗體的表達

A組：參照天津醫(yī)科大學血液腫瘤科標準，各型造血細胞（粒細胞、造血干/祖細胞、紅細胞）與各種自身抗體（IgG .IgM、IgA）的結(jié)合率大于4%為陽性，和（或）CD5+CD19+/CD19+細胞比率明顯偏高：18例擬診斷為免疫相關(guān)性全血細胞減少癥患者中16例骨髓自身抗體檢測結(jié)果陽性，陽性率為88.88% （此16例設(shè)為C組）。參照既往文獻骨髓單個核細胞Coombs試驗陽性率為46.43%<88.88%。

B組：11例巾1例骨髓自身抗體檢測結(jié)果為陽性，陽性率為9.09%，此例陽性患者為再生障礙性貧血患者。比較兩組，未明確診斷組陽性率顯著高于明確診斷組（表1）。骨髓造血細胞自身抗體檢測陽性典型圖例見圖1。

2.1.2 外周血總B淋巴、CD5+B淋巴細胞比率

C組患者總B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞比率為（13.00±6.81）%和（16.71±15.91）%，B組總B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞比率為（9.27±3.52）%和（5.23±2.21）%，正常對照組總B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞比率為（11.9±3.05）%和（8.13±3.96）%。C組CD5+B淋巴細胞、B淋巴細胞比率顯著高于正常對照組及B組（P均<0.05），而正常對照組CD5+B淋巴細胞、B淋巴細胞比率顯著高于B組（P<0.05）。見表2及圖2。

2.2 討論

IRP是臨床多個學科易見的疾病，患者主要臨床表現(xiàn)為出血、貧血、感染及某些臟器受損，僅憑臨床表現(xiàn)和其他血細胞減少癥無法鑒別。邵宗鴻等曾提出此類疾病的擬診標準：血象三系或兩系、一系血細胞減少，但網(wǎng)織紅細胞或（和）中性粒細胞百分比不低；骨髓紅系或（和）粒系百分比小低，或巨核細胞不少，易見紅系造血島或嗜血現(xiàn)象；除外了其他原、繼發(fā)血細胞減少癥。符合以上條件者可擬診IRP（三系血細胞少）或IRH（一系或兩系血細胞少），符合擬診標準者測及骨髓造血細胞膜結(jié)合自身抗體后確診。

對于此類患者骨髓造血細胞膜結(jié)合自身抗體的檢測方法，和虹等發(fā)現(xiàn)此類患者骨髓單個核細胞Coombs試驗陽性。付蓉等提出利用流式細胞術(shù)雙標法檢測此類患者骨髓造血細胞膜結(jié)合的自身抗體，其試驗敏感性較骨髓Coombs試驗更高。近年來有學者發(fā)現(xiàn)了一種基層醫(yī)院易開展的骨髓細胞抗體放散試驗，其敏感性也比Coombs試驗高。分析既往檢測方法發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的實驗方法是用外周血或/和骨髓做Coomb's試驗來診斷溶血的原因。然而如果抗體是針對骨髓早期造血細胞（造血干/祖細胞、有核紅細胞、有核粒細胞），傳統(tǒng)方法將無法榆測到抗體存在。因而利用流式細胞術(shù)可標記早期造血細胞，并對其表面抗體表達進行檢測的特點，可以解決這一技術(shù)難點。B淋巴細胞是骨髓造血細胞自身抗體的產(chǎn)生機制，現(xiàn)已有研究證實IRP患者自身抗體的產(chǎn)生與B淋巴細胞及其亞群數(shù)量異常、功能亢進及調(diào)亡受抑有關(guān)。Seidi等住多發(fā)性硬化癥中觀察到CD5+B細胞與髓鞘蛋白抗體產(chǎn)生有關(guān)，并且也與多發(fā)性硬化的活動期有關(guān)；Huck等研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）得出同樣結(jié)論，發(fā)現(xiàn)活動期SLE患者的CD5+B細胞是升高的，而非活動期SLE患者CD5+B細胞是下降的，提示CD5+B細胞的改變與SLE病情活動有關(guān)。2005年研究者發(fā)現(xiàn)：此類患者B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞比率明顯高于正常對照組，并進一步發(fā)現(xiàn)此類患者B淋巴細胞并非單克隆的惡性細胞。

本文檢測IRP患者和其他惡性mL液病患者外周血B淋巴細胞及其CD5+B淋巴細胞結(jié)果顯示，IRP患者外周血CD5+B淋巴細胞比率顯著高于惡性血液病患者及正常對照組。結(jié)合臨床分析發(fā)現(xiàn)，確診IRP患者中B淋巴細胞數(shù)量、亞群比率及功能異常，進而使B淋巴細胞生存時間延長，促進抗體分泌，導(dǎo)致患者全血細胞減少。這與既往研究結(jié)果相一致，即Thl型細胞因子介導(dǎo)B淋巴細胞凋亡，IRP患者Thl型細胞因子較正常人，特別是AA明顯降低。正常對照組外周血 CD5+B淋巴細胞顯著高于惡性血液病患者，B組中MDS、AA、PNH這類疾病均是骨髓造血功能出現(xiàn)障礙或異常的骨髓造血功能衰竭性疾病，尤其是AA是一類T淋巴細胞功能亢進，通過細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）直接殺傷或凋亡骨髓導(dǎo)致的造血功能衰竭癥，這些不穩(wěn)定因素可能導(dǎo)致B組CD5+B淋巴細胞比率偏低。提示此類疾病可能因骨髓造血功能衰竭而致CD5+B淋巴細胞比率偏低。

3 結(jié)論

對比傳統(tǒng)的骨髓單個核細胞Coombs試驗，利用流式細胞術(shù)檢測骨髓單個核細胞自身抗體靈敏性顯著增高。IRP患者B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞顯著高于非免疫性惡性血液病患者，此亦可以作為診斷MDS、AA、PNH等疾病時的鑒別參考之一。本實驗檢測還發(fā)現(xiàn)非免疫性的惡性血液病患者B淋巴細胞、CD5+B淋巴細胞比率顯著低于正常對照組，文章中作了部分分析，深層次的原因還有待于進一步的研究。