梁艷艷　郝云良

【摘要】目的：評(píng)價(jià)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer，CIK）治療多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者的臨床療效。方法：回顧性分析35例化療治療后達(dá)CR的MM患者，包括序貫免疫治療組（A組）20例，非序貫免疫治療組（B組）15例。應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞儀（FCM）以骨髓瘤細(xì)胞（MC）特異分化抗原為標(biāo)志檢測患者骨髓微小殘留病灶（MRD），觀察A組CIK細(xì)胞輸注治療前后MRD的變化，CIK治療結(jié)束后每3個(gè)月行MRD監(jiān)測，B組為對(duì)照組，獲CR后每3個(gè)月行MRD監(jiān)測，并隨訪觀察兩組之間MRD變化的差別。結(jié)果：A組患者CIK治療結(jié)束后MRD轉(zhuǎn)陰率為30%，B組患者隨訪中無1例轉(zhuǎn)陰；A、B組患者治療結(jié)束后半年及1年時(shí)MRD復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A組中不同CIK療程患者的半年及1年時(shí)MRD復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：MM患者應(yīng)用CIK治療具有明顯清除MRD的作用，且多療程治療效果更顯著，具有延緩復(fù)發(fā)的作用，且臨床應(yīng)用安全。

【關(guān)鍵詞】多發(fā)性骨髓瘤；流式細(xì)胞術(shù)；CIK治療；微小殘留病灶

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是B細(xì)胞起源的骨髓克隆性漿細(xì)胞惡性增生和異常積累，并伴單克隆免疫球蛋白增多為特征的一種衰竭性、不可治愈的惡性疾病[1]。微小殘留?。∕RD）是指經(jīng)治療獲得完全緩解（CR）后體內(nèi)殘留少量血液腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)，被認(rèn)為是疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)的根源[2]。近些年，隨著流式細(xì)胞術(shù)的快速發(fā)展，它已經(jīng)成為MM診斷、鑒別診斷和分型的重要依據(jù)[3]，并可通過流式細(xì)胞儀對(duì)MM患者骨髓細(xì)胞進(jìn)行微小殘留病灶（MRD）監(jiān)測，指導(dǎo)治療及預(yù)后[4]。

資料與方法

研究對(duì)象：2010年9月～2013年5月在濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院及菏澤市市立人民醫(yī)院確診并經(jīng)VAD/PD方案化療或聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植治療后達(dá)CR的MM患者35例，診斷依據(jù)均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。其中男22例，女13例，平均年齡50～75歲，平均年齡62歲，標(biāo)本均為患者骨髓。隨訪時(shí)間6～38個(gè)月，平均時(shí)間19個(gè)月。

研究方法：CIK治療：A組患者于化療結(jié)束達(dá)CR后采集外周血，所分離的PBMNC在體外進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)并培養(yǎng)，于第15天時(shí)回輸給患者，每次回輸細(xì)胞（2.5～5.0）×10-9個(gè)（內(nèi)毒素和無菌檢測依據(jù)《中華人民共和國藥典》2005版）?；剌敃r(shí)將細(xì)胞離心洗滌，于100ml生理鹽水重懸后靜滴，靜滴前給予異丙嗪25mg肌注，并于2h內(nèi)靜脈滴注結(jié)束，觀察其不良反應(yīng)。半個(gè)月后重復(fù)上述過程，大約1個(gè)月行1次CIK治療，1～5個(gè)療程不等。

儀器與試劑：流式熒光單抗、溶血?jiǎng)┵徸悦绹鳥D公司。流式細(xì)胞儀為BD FACSCalibur，流式分析軟件為FCS Express4.0。

MRD監(jiān)測：采用活細(xì)胞直接免疫熒光標(biāo)記的四參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FCM，BD，USA），利用CD45/SSC設(shè)門采集細(xì)胞，F(xiàn)CS Express4.0分析軟件分析多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓各群細(xì)胞CD45、CD38、CD56、CD19、CD138及CD28、CD117等表達(dá)，膜抗原≥20%為陽性，進(jìn)行MRD監(jiān)測。以骨髓瘤相關(guān)免疫表型（MAIP+）細(xì)胞比例≥0.0001且<0.05為MRD陽性；MAIP+細(xì)胞（MC）<0.0001為MRD陰性。FCM檢測發(fā)現(xiàn)MAIP+細(xì)胞（MC）≥0.05為復(fù)發(fā)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

MRD隨訪：A組于CIK治療結(jié)束后及B組化療結(jié)束后開始隨訪，至MRD復(fù)發(fā)隨訪結(jié)束，未復(fù)發(fā)者隨訪至今，隨訪時(shí)間3～38個(gè)月，平均16個(gè)月。

CIK治療不良反應(yīng)：治療期間持續(xù)觀察患者的體溫、呼吸、脈搏及血壓生命體征情況。不良事件根據(jù)CTCEA（Common Terminology Criteria for Adverse Events）3.0版記錄。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。觀察A組中≤2療程（A1）及>2個(gè)療程CIK治療組（A2）及B組之間的MRD差別，分為MRD轉(zhuǎn)陰、持續(xù)陽性及復(fù)發(fā)三種情況。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，比較各組之間的差別，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

A組患者經(jīng)化療達(dá)CR后，仍有18例（90%）患者應(yīng)用FCM能檢測到≥1.0×104的MRD，B組均能檢測到≥1.0×104的MRD，其余患者M(jìn)RD值（0.3～4.2）×102，差異很大。A組經(jīng)給予CIK治療（1～5個(gè)療程）后，MRD水平可明顯下降，且有6例（30%）患者M(jìn)RD轉(zhuǎn)陰，且隨著CIK療程數(shù)的增加，隨訪中發(fā)現(xiàn)≤2療程CIK治療組（A1）和>2個(gè)療程CIK組（A2）半年及1年時(shí)MRD復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組患者隨訪中無1例轉(zhuǎn)陰。A、B組患者治療結(jié)束后半年及1年時(shí)MRD復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

不良反應(yīng)：CIK治療組有4例（20%）患者在回輸后出現(xiàn)一過性輕微畏寒、低熱，經(jīng)給予對(duì)癥處理后癥狀消失，且未再反復(fù)。

討論

多發(fā)性骨髓是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，常規(guī)化療緩解率低，雖然新一代藥物硼替佐米、雷利度胺等的應(yīng)用及大劑量化療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植取得了較大成效，但仍面臨復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。究其原因是化療尚無法徹底清除瘤細(xì)胞，微小殘留病灶（MRD）使MC容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并誘發(fā)耐藥。目前，如何能鞏固已經(jīng)獲得CR的MM患者的療效，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，以期獲得長期無病生存，甚至治愈，已成為眾多學(xué)者研究的問題。

近年來，過繼細(xì)胞免疫治療發(fā)展迅速，其中CIK治療已成為熱點(diǎn)，但若單獨(dú)臨床應(yīng)用，療效并不佳。當(dāng)前的共識(shí)是首先應(yīng)用化療將腫瘤負(fù)荷降至最低，再選用理想的免疫治療方案在不增加治療毒性的基礎(chǔ)上產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)的協(xié)同作用。化療后序慣治療或者其他維持治療能進(jìn)一步減少M(fèi)RD，是改善預(yù)后的重要策略之一[5]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在MM患者經(jīng)過化療達(dá)CR的基礎(chǔ)上，序貫CIK治療，結(jié)果表明能進(jìn)一步殺滅殘存腫瘤細(xì)胞，甚至使MRD轉(zhuǎn)陰。

Dworzak等很早就在急性白血病方面研究化療以后MRD水平是否能降到10-4以下對(duì)患者能否長期生存具有重要意義[6]。但對(duì)于MM患者而言，由于MC在骨髓中往往呈灶狀分布，且MC與正常漿細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上容易混淆，靈敏度低，僅能達(dá)到5×102水平[7]。血、尿蛋白電泳可間接反映腫瘤負(fù)荷量，但特異性較低，敏感度也不高，用來分析MRD亦有一定局限性。目前隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了通過流式細(xì)胞儀對(duì)MM患者骨髓細(xì)胞進(jìn)行MRD監(jiān)測，且有利于治療評(píng)估和預(yù)后判斷，且其意義大于初發(fā)診斷[8-9]。目前常用CD138+/CD38+++/CDl9—和CD138+/CD38+++/CD56+的表型檢測MM的MRD，該方法最高敏感性可達(dá)1.0×10-4水平[10]。無論在任何檢測點(diǎn)，只要MC>0.0001，就存在復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。

本研究中A組20例MM患者獲CR后經(jīng)給予序慣CIK（1～5個(gè)療程）治療，已有6例患者M(jìn)RD轉(zhuǎn)陰，未能轉(zhuǎn)陰的患者M(jìn)RD水平亦不同程度下降，B組15例MM患者獲CR后，無1例患者M(jìn)RD轉(zhuǎn)陰，且有明顯升高趨勢。隨著治療的結(jié)束，兩組患者M(jìn)RD均有上升趨勢，且部分病例復(fù)發(fā)。A組CIK治療結(jié)束后與B組化療結(jié)束后，隨訪觀察中發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間延長，兩組之間復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明CIK治療不但能進(jìn)一步清除殘存的腫瘤細(xì)胞，且隨著CIK療程的增加，療效更顯著，且有延緩復(fù)發(fā)，甚至治愈可能。劉紅偉等研究不同療程CIK治療之間的療效比較時(shí)發(fā)現(xiàn)多療程CIK治療效果優(yōu)于單療程CIK治療的患者[11]，多次CIK治療延長腫瘤患者生存期，提高生活質(zhì)量，對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)有較好的作用，這與我們的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果認(rèn)為，在MM患者經(jīng)化療治療達(dá)CR后應(yīng)用CIK治療，可進(jìn)一步清除MRD，同時(shí)還可改善患者免疫狀態(tài)和生活質(zhì)量，延緩復(fù)發(fā)，進(jìn)一步提高臨床治療效果，為MM患者提供了新的治療策略。但是MM患者異質(zhì)性強(qiáng)，參數(shù)變量不易統(tǒng)一，這種聯(lián)合治療的分子機(jī)制及方案配置的優(yōu)化等問題還需進(jìn)一步的研究和論證[12]。鑒于CIK治療具有獨(dú)特的抗瘤優(yōu)勢和免疫支持作用，而且安全可靠，很可能在未來成為MM患者的根治方法[13]，值得臨床應(yīng)用推廣。

參考文獻(xiàn)

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本研究中A組20例MM患者獲CR后經(jīng)給予序慣CIK（1～5個(gè)療程）治療，已有6例患者M(jìn)RD轉(zhuǎn)陰，未能轉(zhuǎn)陰的患者M(jìn)RD水平亦不同程度下降，B組15例MM患者獲CR后，無1例患者M(jìn)RD轉(zhuǎn)陰，且有明顯升高趨勢。隨著治療的結(jié)束，兩組患者M(jìn)RD均有上升趨勢，且部分病例復(fù)發(fā)。A組CIK治療結(jié)束后與B組化療結(jié)束后，隨訪觀察中發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間延長，兩組之間復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明CIK治療不但能進(jìn)一步清除殘存的腫瘤細(xì)胞，且隨著CIK療程的增加，療效更顯著，且有延緩復(fù)發(fā)，甚至治愈可能。劉紅偉等研究不同療程CIK治療之間的療效比較時(shí)發(fā)現(xiàn)多療程CIK治療效果優(yōu)于單療程CIK治療的患者[11]，多次CIK治療延長腫瘤患者生存期，提高生活質(zhì)量，對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)有較好的作用，這與我們的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果認(rèn)為，在MM患者經(jīng)化療治療達(dá)CR后應(yīng)用CIK治療，可進(jìn)一步清除MRD，同時(shí)還可改善患者免疫狀態(tài)和生活質(zhì)量，延緩復(fù)發(fā)，進(jìn)一步提高臨床治療效果，為MM患者提供了新的治療策略。但是MM患者異質(zhì)性強(qiáng)，參數(shù)變量不易統(tǒng)一，這種聯(lián)合治療的分子機(jī)制及方案配置的優(yōu)化等問題還需進(jìn)一步的研究和論證[12]。鑒于CIK治療具有獨(dú)特的抗瘤優(yōu)勢和免疫支持作用，而且安全可靠，很可能在未來成為MM患者的根治方法[13]，值得臨床應(yīng)用推廣。

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本研究中A組20例MM患者獲CR后經(jīng)給予序慣CIK（1～5個(gè)療程）治療，已有6例患者M(jìn)RD轉(zhuǎn)陰，未能轉(zhuǎn)陰的患者M(jìn)RD水平亦不同程度下降，B組15例MM患者獲CR后，無1例患者M(jìn)RD轉(zhuǎn)陰，且有明顯升高趨勢。隨著治療的結(jié)束，兩組患者M(jìn)RD均有上升趨勢，且部分病例復(fù)發(fā)。A組CIK治療結(jié)束后與B組化療結(jié)束后，隨訪觀察中發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間延長，兩組之間復(fù)發(fā)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明CIK治療不但能進(jìn)一步清除殘存的腫瘤細(xì)胞，且隨著CIK療程的增加，療效更顯著，且有延緩復(fù)發(fā)，甚至治愈可能。劉紅偉等研究不同療程CIK治療之間的療效比較時(shí)發(fā)現(xiàn)多療程CIK治療效果優(yōu)于單療程CIK治療的患者[11]，多次CIK治療延長腫瘤患者生存期，提高生活質(zhì)量，對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)有較好的作用，這與我們的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果認(rèn)為，在MM患者經(jīng)化療治療達(dá)CR后應(yīng)用CIK治療，可進(jìn)一步清除MRD，同時(shí)還可改善患者免疫狀態(tài)和生活質(zhì)量，延緩復(fù)發(fā)，進(jìn)一步提高臨床治療效果，為MM患者提供了新的治療策略。但是MM患者異質(zhì)性強(qiáng)，參數(shù)變量不易統(tǒng)一，這種聯(lián)合治療的分子機(jī)制及方案配置的優(yōu)化等問題還需進(jìn)一步的研究和論證[12]。鑒于CIK治療具有獨(dú)特的抗瘤優(yōu)勢和免疫支持作用，而且安全可靠，很可能在未來成為MM患者的根治方法[13]，值得臨床應(yīng)用推廣。

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