晏嫦妤 黃華林 李家賢 何玉媚

摘要 [目的]對30份山茶屬種質(zhì)資源進(jìn)行分類分析。[方法]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究30份山茶屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并進(jìn)行分類分析。[結(jié)果]17個RAPD引物共擴(kuò)增出138條帶，多態(tài)性條帶為129條，多態(tài)性比率為93.5%，材料間的遺傳相似系數(shù)（GS）變化范圍為0.605～0.855。[結(jié)論]利用NTSYS軟件對RAPD擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，可將30份資源分為5大類群，其分類結(jié)果與張宏達(dá)分類體系基本一致。

關(guān)鍵詞 山茶屬種質(zhì)資源；RAPD；分類

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-04962-02

山茶屬（Genus Camellia）是山茶科（Theaceae）中最大、系統(tǒng)上較原始的一個屬。我國是該屬植物的分布中心，擁有絕大多數(shù)的種類，無論對于亞屬（Subgenus）、組（Section）還是種（Species）的劃分，山茶屬植物在分類學(xué)上都爭議較大。Sealy[1]、張宏達(dá)[2]以及閔天祿[3]在各自的研究基礎(chǔ)上提出了世界著名的3大山茶屬分類系統(tǒng)，但是這3大分類系統(tǒng)之間存在巨大分歧。因此，關(guān)于山茶屬資源的分類研究仍是研究者關(guān)注的熱點。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，從DNA分子水平揭示植物系統(tǒng)演化關(guān)系，使植物系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)入了一個新的時代。筆者根據(jù)張宏達(dá)分類體系中的分類選擇了山茶屬中2個亞屬的5個組的資源，應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行分類分析，旨在對現(xiàn)存分類學(xué)的結(jié)果進(jìn)行初步的驗證，并為解決山茶屬分類分歧問題提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗材料均采自廣東省油茶種質(zhì)資源圃（英德），采集新鮮枝條，帶回實驗室取一芽二葉葉片，用液氮處理后置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩２杉姆N質(zhì)資源的名稱及原產(chǎn)地見表1。

1.2 基因組DNA的提取 采用CTAB法[4]從供試材料中提取基因組DNA，經(jīng)質(zhì)量檢測后，稀釋至200 ng/μl，于-20 ℃保存，用于后續(xù)的RAPD分析。

1.3 RAPD擴(kuò)增 RAPD引物采用40個隨機(jī)引物，篩選出擴(kuò)增多態(tài)性條帶多，穩(wěn)定性強(qiáng)，背景清晰的引物17條（表2）。RAPDPCR反應(yīng)體系為25 μl，包括，模板DNA 50 ng，引物0.5 μl，2×PCR mix（含Taq酶，dNTP，Mg2+等）12.5 μl，用ddH2O補(bǔ)充至25 μl。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，37 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。RAPDPCR產(chǎn)物在1.6%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用自動凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 將電泳圖譜清晰且可重復(fù)的 DNA 條帶記為1，同一位置上的弱帶且不重復(fù)或未出現(xiàn)條帶的記為0，形成“1，0”原始數(shù)據(jù)矩陣，利用 NTSYSpc（2.10）數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用 UPGMA 方法構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 30份山茶屬種質(zhì)資源的多態(tài)性分析 使用17個隨機(jī)引物對30個供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出138個位點，其中多態(tài)性條帶為129條，占總條帶數(shù)的93.5%，每個引物平均獲得7.6條多態(tài)性條帶（圖1）。

2.2 30份山茶屬種質(zhì)資源的聚類結(jié)果分析 利用 NTSYSpc（2.10）數(shù)據(jù)分析軟件，用UPGMA 法建立了30份山茶屬種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系RAPD聚類分析圖（圖2）。RAPD聚類分析結(jié)果表明，30份種質(zhì)資源間的相似系數(shù)在0.605～0.855，當(dāng)相似系數(shù)為0.665時可將30份種質(zhì)資源劃分為5大類群。第1類只有1份資源——金花茶（樣品號：30）。第2類也只有1份資源——張氏紅山茶（樣品號：29）。第3類包括包含2份資源：新興紅花油茶（樣品號：3）和廣寧紅花油茶（樣品號：6）。第4類包含3份資源：香花糙果茶（樣品號：1）、青皮糙果茶（樣品號：9）和紅皮糙果茶（樣品號：10）。第5類包括23份資源，可分為2個亞類：第1亞類包括軟枝油茶3#（樣品號：2）等9份資源，第2亞類包括廣寧白花油茶（樣品號：12）等14份資源。

山茶屬植物是異花授粉植物，遺傳組成上的高度雜合和表現(xiàn)形上的多態(tài)性給植物分類帶來了困難，這也是山茶屬植物分類至今未能定論的主要原因。DNA分子標(biāo)記是DNA序列信息的直接或間接反應(yīng)，為植物系統(tǒng)學(xué)的研究提供了大量的信息數(shù)據(jù)，DNA分子標(biāo)記的分類結(jié)果能夠?qū)ΜF(xiàn)存的分類學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗證，并可能提出新的見解，做出合理的修訂。

通過對比發(fā)現(xiàn)，試驗中RAPD分子標(biāo)記與張宏達(dá)分類體系中對不同組的劃分基本一致，但稍有區(qū)別。根據(jù)張紅達(dá)分類體系可知，30份供試資源分屬于2個亞屬5個組，其中22份資源屬于山茶亞屬油茶組，窄葉短柱茶屬于山茶亞屬短柱茶組，金花茶屬于茶亞屬金花茶組，張氏紅山茶、廣寧紅花油茶和新興紅花油茶屬于山茶亞屬紅山茶組，青皮糙果茶、紅皮糙果茶和香花糙果茶屬于山茶亞屬糙果茶組。從RAPD聚類分析結(jié)果看，22份油茶組資源和窄葉短柱茶聚為一類，說明這2個組的親緣關(guān)系較近，支持了閔天祿對油茶組和短柱茶組合并的觀點[5]。紅山茶組的3份資源，廣寧紅花油茶和新興紅花油茶聚為一類，而張氏紅山茶未與這2份資源聚在一起，分析可能的原因為：在張宏達(dá)分類體系中是根據(jù)其花色等生物學(xué)性狀進(jìn)行分類的，但張氏紅山茶具有四季開花特性，屬多季開花植物，其生理特性與其他2份資源有差異，因此在DNA水平上張氏紅山茶與廣寧紅花油茶和新興紅花油茶可能存在較大差異；糙果茶組的3份資源聚為一類，金花茶單獨(dú)為一類，這2組的劃分與張宏達(dá)分類體系中的分類一致。據(jù)鄧白羅[6]等研究表明，RAPD分析結(jié)果基本上支持張宏達(dá)的山茶屬紅山茶組植物分類方法，說明形態(tài)上的相似性與DNA的相似性有很強(qiáng)的相關(guān)性，試驗結(jié)果也表明，RAPD的分類結(jié)果與張宏達(dá)分類體系較為一致，但也存在部分差異。因此，利用分子標(biāo)記方法，并與傳統(tǒng)分類方法進(jìn)行相互驗證，將使山茶屬植物的分類系統(tǒng)趨于更加科學(xué)合理化。

參考文獻(xiàn)

[1] SEALY J R.A revision of the genus Camellia[M].London：the Royal Horticulture Society，1958.

[2] 張宏達(dá)，任善湘.中國植物志，第49卷，第3分冊[M].北京：科學(xué)出版社，1998.

[3] 閔天祿.世界山茶屬的研究[M].昆明：云南科技出版社，2000.

[4] 黃建安，黃意歡，羅軍武，等.茶樹基因組DNA的高效提取方法[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，29（5）：402-407.

[5] 閔天祿.山茶屬山茶組植物的分類.分化和分布[J].云南植物研究，1998，20（2）：127-148.

[6] 鄧白羅，譚曉風(fēng)，漆龍霖，等.山茶屬紅山茶組植物的RAPD分析及分類研究[J].林業(yè)科學(xué)，2006，42（5）：36-40.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：4969-4970，4973

責(zé)任編輯 石金友 責(zé)任校對 李巖