劉敏 顧志敏

摘要 [目的]獲得高產(chǎn)量的煙草葉片原生質(zhì)體。[方法]在前人的基礎(chǔ)上，在酶濃度和酶解時(shí)間上，對簡易大量制備本氏煙葉原生質(zhì)體的條件進(jìn)行了進(jìn)一步的探索；并以此為基礎(chǔ)，通過雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)進(jìn)一步研究了其在蛋白互作研究中的應(yīng)用。[結(jié)果]在纖維素酶濃度為1.3%，離析酶濃度為0.4%，果膠酶濃度為0.3%，酶解4 h，酶解溫度28 ℃，并在簡易純化的條件下制備原生質(zhì)體，所得到的完整原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，并且細(xì)胞碎片和雜質(zhì)均最少。[結(jié)論]該方法為瞬時(shí)表達(dá)于本氏煙葉中的熒光蛋白研究提供了重要的技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 煙草（Nicotiana benthamiana）；原生質(zhì)體制備；雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)；蛋白互作

中圖分類號 S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05002-05

植物原生質(zhì)體（protoplast）一詞始自Hanstein，即指通過質(zhì)壁分離，脫去細(xì)胞壁的細(xì)胞[1]。細(xì)胞壁是植物細(xì)胞的圍墻，用其相對堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)包圍著其內(nèi)部的原生質(zhì)體，保護(hù)和支撐著植物細(xì)胞，其主要成分為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)等。在原生質(zhì)體的所有分離方法中，酶解法效果最佳[2]。隨著植物生物學(xué)的發(fā)展，原生質(zhì)體已經(jīng)越來越廣泛應(yīng)用于植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、體細(xì)胞遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域[1]，是生理生化研究、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因定位研究、細(xì)胞器制備、細(xì)胞融合和新品種培育等研究的理想材料[3]。

目前，原生質(zhì)體在植物分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，其中就包括蛋白亞細(xì)胞定位和蛋白間相互作用研究。亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位。例如在核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或者細(xì)胞膜上存在。GFP是綠色熒光蛋白，將所研究蛋白與GFP融合構(gòu)建到一個(gè)同框閱讀框內(nèi)，然后轉(zhuǎn)化到植物中，提取原生質(zhì)體，在掃描共聚集顯微鏡的激光照射下觀察綠色熒光信號，從而可以精確地定位蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置。植物原生質(zhì)體雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)（簡稱BiFC）使得活細(xì)胞內(nèi)的蛋白互作可視化[4]。這種方法被成功的應(yīng)用到不同生物中的不同表達(dá)系統(tǒng)。BiFC的基本原理是，增強(qiáng)的黃色熒光蛋白（eYFP）的片段通過分別融合到其末端的連接蛋白的互作重新形成熒光復(fù)合體。蛋白復(fù)合體的熒光能清晰觀察到熒光的空間定位，如果連接的2個(gè)蛋白不互作，則只會形成背景熒光[5-6]。

煙草作為一種模式植物，其發(fā)育生長周期非常快，在短期內(nèi)就能繁育多代。且易于進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染試驗(yàn)，熒光蛋白分子在煙草內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)后，易于觀察。國內(nèi)外眾多研究者提出了許多制備煙草原生質(zhì)體的方法，比如機(jī)械法、化學(xué)法和酶解法等，其中酶解法是目前最有效、最快速、效果最佳的分離植物原生質(zhì)體的方法[2]。目前很多文獻(xiàn)只是提及煙草原生質(zhì)體制備的方法和步驟，對其在植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道。因此，筆者優(yōu)化煙草原生質(zhì)體制備過程中多種因素的設(shè)置，并利用改良后的制備體系，以期為煙草原生質(zhì)體在蛋白互作中的應(yīng)用提供一些可供參考的范例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。煙草種子（Nicotiana benthamiana），由浙江師范大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)與作物病害防控重中之重學(xué)科提供。

1.1.2 載體。所用BiFC載體pSPYCE.A、pSPYCE.C和pSPYNE.B、pSPYNE.D均由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；CBL1n：OFP為質(zhì)膜定位標(biāo)記蛋白和TPC1：OFP為液泡膜定位標(biāo)記蛋白，均由德國明斯特大學(xué)Jorg Kudla提供。將以上載體經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化入GV3101農(nóng)桿菌中。

1.2 方法

1.2.1 樣品的初處理。取煙草種子，用75%的酒精浸泡30 s后，蒸餾水沖洗，然后用30%的次氯酸鈉浸泡30 min，再用蒸餾水浸種過夜。次日，播種于適宜濕度全元素培養(yǎng)土中，置于恒溫培養(yǎng)箱（光照14 h，28 ℃；黑暗10 h，25 ℃）培養(yǎng)；長出4片葉（約25 d）或6片葉（約35 d）時(shí)移栽至單個(gè)塑料培養(yǎng)杯內(nèi)。移栽培養(yǎng)約25 d后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。

1.2.2 農(nóng)桿菌浸染接種。采用Walter的方法[4]并作修改。挑取含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌于YEP液體培養(yǎng)基（Kan，75 μg/ml；Rif，25 μg/ml）中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；取60 μl菌液至含有終濃度為2 mmol/L MgSO4、10 mmol/L MES（pH5.8）、75 mg/L Kan、50 mg/L Rif和20 μmol/L AS的YEBi培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600約為0.7左右；4 ℃，5 000 r/min離心10 min，去上清；加入含有終濃度為10 mmol/L MES（pH 5.8）和200 μmol/L AS的MMAi培養(yǎng)基于25 ℃，65 r/min條件下恢復(fù)培養(yǎng)3～4 h，至OD600約為2.8；將含pSPYCE.X載體的農(nóng)桿菌菌液分別跟含pSPYNE-Y載體的農(nóng)桿菌菌液等體積兩兩混合，振蕩混勻；在每株4～8周大小的本氏煙上選取3～4片葉片，用1.0 ml注射器針頭在選取的每片葉片背部刺1～2個(gè)小孔，一只手按住葉面的小孔處，另一只手用無針頭的針管從葉的背面將菌液沿小孔慢慢注入葉片組織空隙中；浸染接種后的煙草置于24 ℃條件下培養(yǎng)；農(nóng)桿菌侵染后3～7 d可進(jìn)行原生質(zhì)體制備。

1.2.3 原生質(zhì)體制備。原生質(zhì)體制備過程中使用到的試劑參考Walter的方法[4]。

1.2.4 原生質(zhì)體的快速游離和純化。取農(nóng)桿菌侵染3 d后的煙草葉片，用尖頭鑷子夾住葉脈，從葉柄到葉尖方向撕取葉下表皮0.2～0.3 g，展平置于500 mmol/L 甘露醇中，培養(yǎng)30～60 min；甘露醇培養(yǎng)后，吸除甘露醇，加入500 μl的原生質(zhì)體溶解液，真空培養(yǎng)5 min；45 r/min，28 ℃暗培養(yǎng)4 h，使原生質(zhì)體充分釋放。原生質(zhì)體的簡易純化參考Walter的方法[4]，其中轉(zhuǎn)速調(diào)整為300 r/min。通過共聚焦顯微鏡快速分析所制備的原生質(zhì)體。

1.2.5 原生質(zhì)體的觀察。吸取40 μl制備好的原生質(zhì)體溶液，制片，置于熒光共聚焦倒置顯微鏡（Leica TCS SP5）下，用相應(yīng)波長激發(fā)光激發(fā)，顯微鏡倍數(shù)設(shè)置為20×0.7，觀察視野內(nèi)原生質(zhì)體數(shù)并拍照，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取10～50個(gè)視野拍照。試驗(yàn)最終使用的W5均為80 μl。

1.2.6 原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)。（1）不同酶濃度組合所獲原生質(zhì)體比較.試驗(yàn)重復(fù)3次，每次觀察50個(gè)視野。以下“原生質(zhì)體數(shù)/個(gè)”表示50個(gè)視野內(nèi)原生質(zhì)體個(gè)數(shù)的平均值。（2）不同酶解時(shí)間所獲原生質(zhì)體比較。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次觀察10個(gè)視野。所用酶濃度為4%纖維素酶；1%離析酶（Japan），采用5個(gè)酶解時(shí)間對比。以下“原生質(zhì)體數(shù)/個(gè)”表示10視野內(nèi)原生質(zhì)體個(gè)數(shù)的平均值。

所用蓋玻片為22×22 mm2，單個(gè)視野大小為750×750 μm2，所以每0.2 g產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)為（蓋玻片面積/單個(gè)視野面積）×單個(gè)視野原生質(zhì)體數(shù)均值×2。

1.2.7 原生質(zhì)體產(chǎn)量的計(jì)算。每克本氏煙的原生質(zhì)體產(chǎn)量=原生質(zhì)體總數(shù)=單個(gè)視野原生質(zhì)體數(shù)均值×（蓋玻片面積/單個(gè)視野面積）×2×5。

2 結(jié)果與分析

2.1 簡易大量制備原生質(zhì)體條件探索

2.1.1 不同酶解時(shí)間所獲原生質(zhì)體比較。試驗(yàn)比較了不同酶解時(shí)間酶解原生質(zhì)體的情況；試驗(yàn)條件為采用5種酶解時(shí)間對比，所用酶濃度為3.0%纖維素酶（Cellulose R.10 Japan）；0.75%離析酶（Cellulose R.10 Japan），其他條件相同。

2.1.2 不同酶濃度酶解效果比較。試驗(yàn)比較了在不同酶濃度下原生質(zhì)體的解離情況；試驗(yàn)條件為采用4種酶濃度對比，酶解時(shí)間為4 h，其他條件相同。由表1和圖3～4可知，纖維素酶（Cellulose R.10 Japan）濃度為1.3%，離析酶（Mecerozyme R.10及 Japan）濃度為0.75%，果膠酶（Pectinase R.10 Japan）濃度為0.1%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)率最高，完整原生質(zhì)體個(gè)數(shù)也最多，視野內(nèi)雜質(zhì)較少，原生質(zhì)體清晰。

2.2 原生質(zhì)體制備在蛋白互作研究中的應(yīng)用 將連接了目的基因的BiFC雙元載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101，侵染本氏煙3 d后制備成原生質(zhì)體。通過原生質(zhì)體熒光定位，能更直觀觀察到互作蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果表明，連接了不同目的基因的BiFC雙元載體侵染的煙草，其熒光定位于細(xì)胞內(nèi)不同部位，包括質(zhì)膜、液泡膜等。

2.2.1 質(zhì)膜與核熒光定位分析。圖5表明，A與B互作所形成的復(fù)合體，其熒光在質(zhì)膜與核上均有分布[7]，在細(xì)中也有可能存在分布，這預(yù)示著A與B可能通過相互作用在質(zhì)膜與核上行使其功能。

2.2.2 液泡膜熒光定位分析。植物液泡種類多樣，并且其功能各不相同。植物細(xì)胞內(nèi)主要分布有中央大液泡和貯存性液泡[8]，其上分布的蛋白可能具有不同的功能。試驗(yàn)通過對煙草原生質(zhì)體的觀察，更清楚的觀察到了液泡在細(xì)胞中的各種形態(tài)以及相應(yīng)的熒光模式。圖6左圖表明，C/D復(fù)合體所形成的熒光可能位于中央大液泡PSV上，也有可能在細(xì)胞質(zhì)中也有熒光分布。但或許由于拍攝角度的不同，其熒光的呈現(xiàn)不是規(guī)則的膜熒光；圖6右圖表明，復(fù)合體的熒光則聚集于靠近細(xì)胞邊緣的液泡上，輕微的質(zhì)壁分離可能導(dǎo)致了液泡膜形狀的不規(guī)則。圖7表明，E/F復(fù)合體所形成的熒光在細(xì)胞膜類似膜與囊泡膜上均有分布，這3類膜熒光分布圖可能由于拍攝角度的不同使得熒光模式有不同的呈現(xiàn)形式。這些囊泡膜可能是未成熟的液泡。以上的結(jié)果預(yù)示著C與D以及E與F可能通過相互作用在液泡膜膜上行使其功能。

3 結(jié)論與討論

對于煙草原生質(zhì)體的制備方法，國內(nèi)外許多研究者提出了許多的方法，比如有機(jī)械法、化學(xué)法和酶解法等，但很多方法都比較陳舊，并且效率非常低，在試驗(yàn)中可重復(fù)性不強(qiáng)。因此試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，對高效、快速制備煙草原生質(zhì)體的方法進(jìn)行了優(yōu)化，并對其在植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行了示例。結(jié)果顯示，在纖維素酶濃度為1.3%，離析酶濃度為0.4%，果膠酶濃度為0.3%，酶解4 h，酶解溫度28 ℃，并在簡易純化的條件下制備原生質(zhì)體，所得到的完整原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，并且細(xì)胞碎片和雜質(zhì)均最少，這對于瞬時(shí)表達(dá)于本氏煙葉中的熒光蛋白研究提供了重要的技術(shù)參考。

酶解時(shí)間在原生質(zhì)體的制備中是一個(gè)非常重要的因素。酶解時(shí)間過短，酶解不充分，原生質(zhì)體得不到很好的釋放；酶解時(shí)間過長，質(zhì)膜受到損傷[2，9]，原生質(zhì)體的穩(wěn)定性也較差，不利于制備以及最終的觀察。原生質(zhì)體失去細(xì)胞壁的保護(hù)后變得非常脆弱。因此，制備原生質(zhì)體所用各種溶液中的滲透壓穩(wěn)定劑對于制備完整原生質(zhì)體非常重要。尤其是原生質(zhì)體懸浮液W5中的滲透壓穩(wěn)定劑，決定了最終完整原生質(zhì)體的數(shù)量以及保存時(shí)間。原生質(zhì)體的收集方法對于原生質(zhì)體的產(chǎn)率和活力也非常重要[3]。試驗(yàn)采用了35 μm尼龍網(wǎng)過濾以及300 r/min的低速離心收集，降低了原生質(zhì)體在收集過程中破碎的可能性。另外，對煙草來說，撕表皮法比剪碎法更利于原生質(zhì)體的釋放。撕表皮法對于煙葉的質(zhì)量要求較高，起皺的葉片不利于原生質(zhì)體的制備，平展健壯的葉片更佳。

將本氏煙葉原生質(zhì)體制備應(yīng)用到BiFC中，先侵染后制備的方法，相比于其他生物如水稻原生質(zhì)體的先制備后侵染，更高效更直觀。相比于完整煙葉細(xì)胞中的熒光定位，原生質(zhì)體中的熒光定位能更清晰明了地觀察到蛋白互作位點(diǎn)或蛋白的亞細(xì)胞定位位點(diǎn)。這一點(diǎn)對于蛋白功能的明確大有裨益。近年來，煙草原生質(zhì)體制備在BiFC中的應(yīng)用極大地推動了蛋白互作以及蛋白功能確定的研究，已經(jīng)成為細(xì)胞中各細(xì)胞器或其他組成物質(zhì)功能研究的重要手段。

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