曾超 代金玲 白玉娥 呼都特

摘要 林木的體細胞胚胎發(fā)生是體細胞在人工無菌培養(yǎng)條件下分化產(chǎn)生體細胞胚胎的過程，該技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分，不僅在遺傳改良和快速繁殖等方面有著重大意義，也展現(xiàn)出了在實際生產(chǎn)中良好的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢。文章綜述了體細胞胚胎發(fā)生的幾個重要影響因子——材料、培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑以及培養(yǎng)條件，提出了今后在林木體細胞胚胎發(fā)生研究方面應(yīng)加強對幼胚的進一步分類、胚性愈傷的區(qū)分、控制體細胞胚胎發(fā)生的同步化等問題的研究。

關(guān)鍵詞 體細胞胚胎發(fā)生；影響因子；林木

中圖分類號 S722.3 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05100-04

林木的體細胞胚胎發(fā)生是體細胞在人工無菌培養(yǎng)條件下分化產(chǎn)生體細胞胚胎的過程。它的相關(guān)研究起源于20世紀(jì)70年代后期。Rao等[1]首次報道檀香（Santalum album Linn.）的體細胞胚胎發(fā)生研究。40多年來，全世界已對50余科180余種木本植物成功地進行了體細胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)并培育出再生植株，其中木本被子植物46科95屬140余種，木本裸子植物7科16屬的50余個樹種[2]。我國從事林木體細胞胚胎發(fā)生和植株再生的技術(shù)研究起步較晚，目前涉及的樹種有松屬（Pinus）[3]、楊屬（Populus）[4]、云杉屬（Picea）[5]、文冠果屬（Xanthoceras）[6]、葡萄屬（Vitis）[7]、橡膠樹屬（Hevea）[8]等數(shù)10個樹種。

體細胞胚胎發(fā)生有2種途徑：直接體細胞胚胎發(fā)生，由外植體直接發(fā)育成體細胞胚；間接體細胞胚胎發(fā)生，由外植體脫分化形成愈傷組織，然后愈傷組織再分化產(chǎn)生體胚。大多數(shù)林木樹種都可以通過第1種途徑產(chǎn)生體細胞胚，其中多以被子植物為主。而針葉樹所屬的裸子植物體胚發(fā)生較難，一般需采用第2種方式產(chǎn)生體細胞胚。體細胞胚的直接發(fā)生一般比間接發(fā)生遺傳穩(wěn)定。周麗儂[9]等在園藝植物體胚發(fā)生和植株再生的研究中得出，外植體和培養(yǎng)條件都會對植物的體胚發(fā)生造成影響。植物體細胞胚胎發(fā)生受到多種內(nèi)因和外因的影響，外植體自身個體的發(fā)育階段和生理狀態(tài)對林木組織培養(yǎng)成功與否起關(guān)鍵作用，而外植體的生長和發(fā)育方向由培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度決定[10]。只有合理地調(diào)節(jié)內(nèi)因和外因的作用，才能獲得大量高質(zhì)量的林木體胚。

1 材料

1.1 基因型 基因型是影響林木體細胞胚發(fā)生的主要內(nèi)因。即使選用大小一致的外植體和相同培養(yǎng)條件來誘導(dǎo)塞爾維亞云杉的5個品種植物體胚，其體胚誘導(dǎo)率也各不相同，最高可達18.7%，最低卻只有1.3%[2]。不同基因型的體細胞胚誘導(dǎo)頻率差別很大，其原因可能是不同基因型的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)條件存在著較大的差異。姚娜[11]對10個表現(xiàn)優(yōu)良的毛白楊基因型進行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同毛白楊基因型無論是最佳外植體消毒方法、培養(yǎng)基種類，還是生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度均存在差異。

1.2 外植體 體胚發(fā)生中外植體的篩選是成功的前提。任何細胞均具有全能性，理論上講，植物體的各類器官，如根、莖、葉、花、種子都可以產(chǎn)生體胚。然而體胚發(fā)生要獲得成功不僅依賴于外植體的來源和選擇部位，也跟外植體的生長發(fā)育、生理狀態(tài)有很大關(guān)系。Merkle[12]的研究表明，林木的體胚發(fā)生只能選取種子或幼苗進行誘導(dǎo)，合子胚或種子的不同發(fā)育時期對誘導(dǎo)體胚的影響很大。分化程度較低的組織是利于體胚誘導(dǎo)的最佳外植體[13]。未成熟合子胚因其細胞全能性高、脫分化容易，在誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)生時具有顯著優(yōu)勢[14]。

此外，莖尖、葉片也可以作為誘導(dǎo)體胚的外植體。由于葉和莖中的細胞處于一個非常復(fù)雜的分化時期[15]，所以只能用于山杏[16]、懸鈴木[17]之類體胚發(fā)生較為容易的闊葉樹種。

2 培養(yǎng)基

外植體經(jīng)采集，置冰箱中冷藏（4 ℃）備用。試驗前用水洗凈，浸泡一定時間后，用乙醇、次氯酸等試劑滅菌處理后接入培養(yǎng)基。不同種類植物的體細胞胚胎發(fā)生一般需要選擇不同的培養(yǎng)基。植物組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基主要有MS、LM、SH、N6、WPM、DCR、LP等。

2.1 MS培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基是目前使用最為廣泛的培養(yǎng)基。和其他培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基中硝酸鹽、鉀和銨的含量較高。陳金慧[18]等在對雜交鵝掌楸的體胚研究中發(fā)現(xiàn)，以MS為基本培養(yǎng)基，對體胚的誘導(dǎo)最為有效。習(xí)洋等[19]也成功以刺槐成熟合子胚為外植體，用MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)出體胚。陳夜江[20]認(rèn)為，在果樹體胚的誘導(dǎo)中，常選用MS培養(yǎng)基，因為MS培養(yǎng)基含有較高水平的NH4NO3，對果樹的體胚發(fā)生有促進作用。

2.2 DCR培養(yǎng)基 針葉樹植物體胚誘導(dǎo)需要低濃度NO3-和NH4+，所以含有較低濃度NO3-和NH4+的DCR培養(yǎng)基在針葉樹的組培中應(yīng)用最多[21]。相同激素條件下，DCR培養(yǎng)基對落葉松體胚的誘導(dǎo)效果明顯好于MS培養(yǎng)基[22]。DCR培養(yǎng)基大量元素含量較少，適合松科植物。李茜等[23]研究表明，將白皮松成熟合子胚接種于DCR培養(yǎng)基上，愈傷生長迅速，具有較強的分化能力。李清清[24]采用DCR誘導(dǎo)分化黑松未成熟合子胚，成功建立了黑松的體細胞胚胎發(fā)生體系。

2.3 其他培養(yǎng)基 培養(yǎng)基種類繁多，不同植物、不同階段所選用的培養(yǎng)基各不相同。MS培養(yǎng)基在云杉屬樹種體細胞胚胎的誘導(dǎo)中起阻礙作用，一般常用LP培養(yǎng)基。相比其他培養(yǎng)基，LP培養(yǎng)基鈣鹽含量較高，可以加速植物體內(nèi)代謝，促進生長。濕地松體細胞胚胎發(fā)生在使用DCR培養(yǎng)基時的植株再生率只有10%[25]，而使用了LP培養(yǎng)基培養(yǎng)的濕地松植株再生率顯著提高（25.2%）[26]。北美云杉和紅云杉體細胞胚胎誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基是1/2LM。SH培養(yǎng)基中的有機成分含量明顯高于LM培養(yǎng)基5倍以上，在沙地云杉體胚研究中有很好的應(yīng)用[27]。WPM培養(yǎng)基在闊葉喬木的初代培養(yǎng)當(dāng)中效果較好。B5培養(yǎng)基是文冠果非胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，在弱光中懸浮培養(yǎng)容易形成體細胞胚[28]。根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的不同合理選擇培養(yǎng)基，是體細胞胚胎發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。

3 生長調(diào)節(jié)劑

培養(yǎng)基中附加外源激素和有機物的種類、濃度及組合對體胚的誘導(dǎo)、增殖、分化以及發(fā)育都會產(chǎn)生較大的影響。合理地選擇生長調(diào)節(jié)劑，對建立體細胞胚胎發(fā)生體系尤為重要。

3.1 外源激素

3.1.1 生長素。體胚發(fā)生常用的生長素有2，4.D和NAA。大多數(shù)林木必需在含有2，4.D的培養(yǎng)基下才能誘導(dǎo)體胚發(fā)生。2，4.D可以起到調(diào)節(jié)和平衡內(nèi)源生長素的作用[28]，在已誘導(dǎo)出體胚的植物中，大約有65%單獨或與其他激素搭配使用了2，4.D[29]。然而2，4.D的濃度過高對體胚分化有著不利影響。愈傷組織在含有2，4.D的培養(yǎng)基上長時間培養(yǎng)，容易造成體胚成熟能力的減弱或喪失。一般采取降低濃度繼代或者用作用較弱的NAA替換的方式，這樣有利于體胚的分化和發(fā)育。特別是在增殖培養(yǎng)階段，用NAA代替2，4.D更有利于體細胞胚的發(fā)生[30]。席夢利等[31]研究表明，DCR +6.BA 1.0 mg/L+TDZ 0.003 mg/L+NAA 0.1 mg/L是杉木成熟合子胚誘導(dǎo)體胚的最佳培養(yǎng)基[31]。

3.1.2 細胞分裂素。細胞分裂素同樣是影響體胚發(fā)生與植株再生的重要因子。對于大多數(shù)林木來說，只用生長素很難誘導(dǎo)出體胚，只有將細胞分裂素與生長素合理搭配使用才能有效提高體細胞胚胎發(fā)生概率[10]。一般體胚研究常用的細胞分裂素有6.BA、KT和ZT。呂秀立等[32]的研究表明，誘導(dǎo)歐洲七葉樹愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+2，4.D 2 mg/L+KT 0.2 mg/L，MS+6.BA 8 mg/L+NAA 1 mg/L有利于胚性愈傷的誘導(dǎo)和增殖，添加ZT 2 mg/L或6.BA 5 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基有利于體胚發(fā)育和成熟。

3.1.3 脫落酸（ABA）。脫落酸（ABA）在體胚的成熟和萌發(fā)方面有重要的影響[10]。以花旗松為例，Taber等[33]在體細胞胚發(fā)育的刺激階段和成熟階段均使用了ABA。ABA在植物體細胞胚成熟過程中有著重要的作用[34]。主要表現(xiàn)在以下方面：促進體胚分化，提高正常體胚發(fā)生頻率；抑制早熟體胚的發(fā)生，降低不正常體胚的發(fā)生頻率；提高體胚分化的同步化程度[35]。目前，已經(jīng)成功利用ABA分化出白杄、歐洲落葉松、華北落葉松、濕地松等林木體細胞胚。不同植物種類對ABA濃度的反應(yīng)不同，0.12～0.15 mg/L的ABA可促進橡膠胚性愈傷組織形成體胚[36]，而華北落葉松體胚的成熟培養(yǎng)過程中ABA濃度達到了19 mg/L[37]。單獨使用ABA，有可能抑制體細胞胚發(fā)生[38]。所以進一步明確ABA的最佳作用濃度、添加時間和使用方式，可更好地使用ABA，加速林業(yè)生產(chǎn)。

3.1.4 TDZ。TDZ是新合成的一種雜環(huán)芳香脲，它具有很高的活性，同時擁有生長素和細胞分裂素的雙重特點。TDZ對內(nèi)源植物生長激素起調(diào)節(jié)作用，也可以在誘導(dǎo)逆境中起間接作用，它還具有調(diào)節(jié)細胞膜結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)能量水平等多種作用。到目前為止，TDZ已經(jīng)成功促使近100種組培困難的林木獲得再生植株[39]。有研究表明，TDZ與6.BA搭配使用，可以促進北美喬松成熟合子胚不定芽的發(fā)生[40]。其原因可能是6.BA和TDZ在植物細胞內(nèi)識別位點和代謝途徑各不相同，從而產(chǎn)生各異的生物學(xué)效應(yīng)。席夢利[31]通過杉木的體胚發(fā)生得出結(jié)論，低濃度的TDZ與6.BA配合使用，可以實現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)的互補，提高體胚的分化效率。

植物激素穩(wěn)定性也是一個十分重要的問題。大多數(shù)植物激素難以保持長久，一段時間后會產(chǎn)生難溶沉淀，對體胚發(fā)生造成影響。比如NAA、IBA和KT等3種植物激素在其適宜條件下的保存時間分別最好不要超過40 d、20 d和40 d[41]。每種激素的保存條件都不盡相同，IBA母液必需遮光保存，KT母液必需低溫并遮光保存等。

3.2 其他添加物質(zhì)

3.2.1 蔗糖、氨基酸。植物體細胞胚胎發(fā)生同樣會受到培養(yǎng)基中蔗糖濃度的高低、有機附加物的使用、滲透劑的添加等因素的影響[42]。蔗糖不僅是培養(yǎng)基中最重要的碳源，也對培養(yǎng)基的滲透勢起著調(diào)控作用。氨基酸、水解酪蛋白、香蕉汁等有機附加物可為培養(yǎng)物提供更易代謝的還原態(tài)氮，這在體胚誘導(dǎo)中有特殊的作用。呂守芳等[43]對日本落葉松體胚的研究中對這一推論進行了證實，在體胚誘導(dǎo)、增殖、成熟的培養(yǎng)基中同時使用了450 mg/L谷氨酰胺和500 mg/L水解乳蛋白，體胚誘導(dǎo)率、體胚增殖率、體胚成熟率分別達到15.5%、165.2%、10.57個/g。

3.2.2 活性炭。在培養(yǎng)基中添加活性炭也可以對植物體細胞胚的形成和生長發(fā)育起促進作用。活性炭可以吸附細胞產(chǎn)生的代謝廢物及培養(yǎng)基中部分激素；在體胚成熟階段，為使胚性胚柄團進一步發(fā)育，需使用活性炭除去培養(yǎng)基中的2，4.D和6.BA[26]。

3.2.3 聚乙二醇。聚乙二醇（PEG）分子是一種親水性很強的惰性高分子聚合物，它能改變各類細胞的生物膜結(jié)構(gòu)，在適當(dāng)?shù)臐舛认?，可以通過脅迫作用降低體細胞胚中的含水量，有效地調(diào)控體細胞胚的成熟。唐巍等[26]通過在LP培養(yǎng)基上附加4 mg/L ABA，75 g/L PEG和5 g/L活性炭，使?jié)竦厮傻脑缙谠甙l(fā)育形成了粗壯的子葉胚。

3.2.4 部分離子。部分離子對體細胞胚胎發(fā)生也會產(chǎn)生影響。以枸杞為例，枸杞的愈傷誘導(dǎo)在加入50 mg/L的AgNO3的培養(yǎng)基上體胚發(fā)生率是不加AgNO3的3倍左右。超過此濃度后，Ag+反而會抑制枸杞的體細胞胚發(fā)生[44]。

4 培養(yǎng)條件

植物體細胞胚胎發(fā)生的基本培養(yǎng)方式有3種：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固-液結(jié)合培養(yǎng)。不同的培養(yǎng)方式在體胚發(fā)生中所起的作用都各不相同。體細胞胚在固體培養(yǎng)基上的生長效率和產(chǎn)出質(zhì)量都較高，而液體培養(yǎng)可以改善培養(yǎng)物的供氧情況，提高體細胞胚產(chǎn)量，易于體細胞胚的分離、篩選和收集[45]。

將外植體接入培養(yǎng)基后，需放置在適宜的條件下進行培養(yǎng)。定時繼代對于整個胚胎發(fā)育過程都很重要。固體培養(yǎng)繼代周期為2～3周，液體培養(yǎng)則最多每隔7 d換液1次[46]。光照、溫度等培養(yǎng)條件對誘導(dǎo)林木體胚發(fā)生和植株再生起著重要調(diào)控作用。組織培養(yǎng)一般選擇光培養(yǎng)，而胚性愈傷的誘導(dǎo)、增殖和分化大多采用暗培養(yǎng)[47]，溫度22～25 ℃。Gupta等[48]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)光照條件很大程度上與所選用的培養(yǎng)基相關(guān)。挪威云杉成熟胚利用改良1/2MS培養(yǎng)基在24 h光培養(yǎng)下同樣可以誘導(dǎo)出白色半透明的胚性愈傷，然而，多次繼代后，胚性愈傷容易褐化并局部變綠，這對體胚的后期形成不利[49]。值得注意的是22～27 ℃是胚性愈傷組織最佳的誘導(dǎo)、生長、分化的溫度，當(dāng)超過30 ℃時，胚性愈傷組織將會永久喪失體胚發(fā)生能力。此外，不同階段植物對光照的需求差異很大，蘋果葉片暗培養(yǎng)更有利于促進不定梢再生[50]，而長時間光照不足易引起再生苗玻璃化[51]?？梢姡煌帜倔w細胞胚發(fā)生對于光照、溫度的要求各不相同，不能一概而論，需要逐一進行探索。

5 問題與展望

林木的繁殖方法包括枝條扦插、不定芽的形成和體細胞胚胎發(fā)生3種[52]。體細胞胚胎發(fā)生途徑以高繁殖效率和高同步化水平優(yōu)于傳統(tǒng)的種子繁殖和其他的無性繁殖。該領(lǐng)域研究主要在林木的優(yōu)良基因型快速繁殖、基因轉(zhuǎn)化、種質(zhì)保存及突變體篩選等方面呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[53]。我國的林木體細胞胚胎發(fā)生研究起步較晚，雖然已經(jīng)取得了一定的進展，但仍有很多問題需要進一步探討。

5.1 幼胚的進一步分類 眾多研究表明幼胚是林木體細胞胚胎發(fā)生的最佳外植體。然而幼胚發(fā)育成成熟胚的時間較長，采種期從1～3個月不等。靳小翠[54]每隔10 d左右采種1次，探討了不同的采種期對馬尾松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響。DRAGANA STOJICˇIC'更是提出，體胚產(chǎn)生與否只跟外植體的發(fā)育階段有關(guān)，培養(yǎng)條件只影響體胚發(fā)生的誘導(dǎo)率[55]。因此，對幼胚各個階段進一步分類，尤為必要。

5.2 胚性愈傷的區(qū)分 現(xiàn)如今常規(guī)的區(qū)分胚性愈傷方法是通過制作石蠟切片，根據(jù)體胚細胞學(xué)特性所表現(xiàn)出的4個時期—球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚使用顯微鏡進行觀察。然而就體胚形態(tài)學(xué)上的特征眾說紛紜，普遍認(rèn)知為愈傷呈白色絲狀。具體過程為[56]：非胚性愈傷組織的邊緣出現(xiàn)外起源的原胚突起，原胚橫徑方向迅速生長，胚體發(fā)育成灰白色球形，隨時間胚體增大增長，基部產(chǎn)生明顯的下胚軸，中上部也長出明顯的子葉原基，最終形成具備完整結(jié)構(gòu)的成熟胚。

5.3 控制體細胞胚胎發(fā)生的同步化 一方面要真正實現(xiàn)體細胞胚的工廠化和自動化生產(chǎn)，滿足優(yōu)良品系擴繁及大面積造林的需求，為林業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用開辟一條行之有效的途徑，需要實現(xiàn)體細胞胚胎發(fā)生的同步化[57]。另一方面人工種子的制作也要求胚狀體形態(tài)大小一致，發(fā)育進程相似，即體胚同步，這樣制成的人工種子活力強，萌發(fā)率高[58]。體胚的同步化受到滲透壓、低溫、激素濃度等多個因素影響，目前只在栓皮櫟[59]、水曲柳[57]、荔枝[60]、龍眼[61]等少數(shù)幾種林木中進行過細胞同步化培養(yǎng)及體細胞胚發(fā)生同步控制的研究。

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