劉功良 馬磊 唐漢良 陳嘉玲 白衛(wèi)東

摘要 [目的]優(yōu)化溫差-超聲波復(fù)合法破壁山茶蜂花粉的工藝條件。[方法]以山茶蜂花粉為原料，采用溫差并結(jié)合超聲波輔助的復(fù)合破壁法對山茶蜂花粉進(jìn)行破壁，使花粉破碎，釋放出內(nèi)容物。利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法研究溫差破壁和超聲波破壁的最佳試驗(yàn)條件。[結(jié)果]試驗(yàn)獲得溫差破壁最佳試驗(yàn)條件如下：溫差100 ℃，料液比1∶7 g/ml，冷凍時(shí)間24 h，水浴時(shí)間5 h，水浴溫度45 ℃。在此條件下測得破壁率為68.75%，可溶性總糖的含量為40.02%，游離α.氨基氮的含量為3.58%。對溫差處理過的樣品進(jìn)行超聲波輔助破壁的最優(yōu)工藝為：在超聲10 min的情況下，測得破壁率為72.41%，可溶性總糖含量為46.08%，游離α.氨基氮含量為3.81%。[結(jié)論]該方法破壁效果比較好、成本低、可用于小規(guī)模生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 山茶蜂花粉；破壁；溫差；超聲波

中圖分類號(hào) S896.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-05233-03

蜂花粉是蜜蜂采集植物的花粉加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花粉形成的不規(guī)則扁圓形團(tuán)狀物。它不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、酶類，還含有對人體生理功能具有特殊功效的核酸、黃酮等生物活性物質(zhì)[1-2]。但花粉有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，對胃酸和消化系統(tǒng)酶為非常穩(wěn)定的理化特性[3]，這樣既影響了營養(yǎng)成分的吸收利用，也阻止了提取時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放，因此蜂花粉的破壁及破壁方法尤為重要[4-5]。茶花粉具有特殊的茶香氣息，味道微甜，呈橘紅色，微堿性，涼爽無毒。它富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、維生素、活性酶等多種有效活性成分[6-7]，山茶蜂花粉外壁不易被胃腸道消化，必須進(jìn)行特殊的破壁處理才能使?fàn)I養(yǎng)成分大量釋放出來，被人體消化吸收。

蜂花粉細(xì)胞“破壁”是指對蜂花粉單細(xì)胞的細(xì)胞壁及其萌發(fā)孔進(jìn)行整體破壞或僅破壞萌發(fā)孔的閉鎖點(diǎn)?；ǚ奂?xì)胞會(huì)受到不同程度的損傷，花粉內(nèi)含營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，以利于人體吸收和利用[8-9]。筆者以山茶蜂花粉為原料，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法研究溫差破壁和超聲波破壁的最佳試驗(yàn)條件，使花粉破碎，釋放出內(nèi)容物。

1 材料與方法

1.1 材料 供試山茶蜂花粉由廣州蜂嘜蜂業(yè)有限公司提供。主要試劑：葡萄糖（分析純），廣州一馬環(huán)?？萍加邢薰荆患兹┤芤海ǚ治黾儯?，天津市大茂化學(xué)試劑廠；98%濃硫酸（分析純），廣州化學(xué)試劑；蒽酮試劑（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 破壁率、可溶性總糖、游離α.氨基氮的檢測

1.2.1 破壁率的計(jì)算方法。采用破壁方法處理后，取混懸液制片，鏡檢。鏡檢計(jì)算時(shí)，使用生物顯微鏡10×20放大倍數(shù)，機(jī)械推進(jìn)定位5個(gè)視野，記錄破壁蜂花粉粒總數(shù)目和完整蜂花粉粒數(shù)目[10]。計(jì)算公式：

破壁率%=已破壁花粉粒數(shù)/觀察花粉總粒數(shù)×100

1.2.2 蒽酮比色法測定可溶性總糖。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6 ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液，置入25 ml比色管中，并補(bǔ)水至2.0 ml，加6.0 ml蒽酮試劑，于沸水浴加熱5 min，冷卻，波長620 nm，1 cm比色皿，0號(hào)管為空白，測定吸光度，以葡萄糖量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

可溶性總糖的測定：將水浴完的山茶花粉液體在5 000 r/ min下離心5 min，取5支25 ml比色管，分別加入0.125 ml不同溫差的上清液，定容至25 ml，即稀釋200倍。再從稀釋了200倍的液體中分別吸取1 ml加入到另5支比色管中，定容至10 ml，即一共稀釋了2 000倍。取5支試管，標(biāo)記為1、2、3、4、5，分別加入對應(yīng)溫差的稀釋液2.0 ml，再分別加入6.0 ml蒽酮試劑，沸水浴5 min，冷卻，測吸光值。計(jì)算公式：

式中，m為由吸光值查得對應(yīng)的葡萄糖的含量（μg），a為從總樣品液中取0.125 ml上清液相差的倍數(shù)，M為蜂花粉的質(zhì)量（g）。

1.2.3 甲醛滴定法測定游離α.氨基氮。游離α.氨基氮的測定：吸取0.5 ml上清液，加25 ml去離子水，3滴酚酞試劑，搖勻后用0.01 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴至微紅。再加入10 ml中性甲醛溶液，靜置片刻，再用0.01 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定回到微紅色終點(diǎn)，記下甲醛加入后樣品消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。同樣，取25.5 ml水按以上操作做空白試驗(yàn)。計(jì)算公式：

式中，V為加入甲醛后樣品消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的體積（ml），C為NaOH的濃度（ mol/L），0.014為消耗1 ml 1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)液相當(dāng)于氮的質(zhì)量（g），0.5為取離心后的上清液0.5 ml，b為蜂花粉與去離子水混合后的體積（0.1 ml），m為花粉的質(zhì)量（g）。

1.3 方法

1.3.1 溫差對山茶蜂花粉破壁的影響。將5小袋5 g經(jīng)過研磨的蜂花粉，置于-18 ℃的冰箱中24 h。在相同的料液比（1∶5 g/ml）、水浴溫度（45 ℃）、水浴時(shí)間（5 h）下，考察70、80、90、100、110 ℃[11]這5種不同溫差下山茶蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計(jì)算最佳溫差條件下的破壁率。

1.3.2 料液比對山茶蜂花粉破壁的影響。將5小袋5 g經(jīng)過研磨的蜂花粉，置于-18 ℃的冰箱中24 h。在100 ℃的溫差下，分別以1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11 g/ml的料液比進(jìn)行解凍，然后置于45 ℃的水浴鍋中水浴5 h[12]。測定不同料液比下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計(jì)算最佳料液比下的破壁率。

1.3.3 水浴時(shí)間對山茶蜂花粉破壁的影響。稱取5小袋5 g經(jīng)研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中冷凍 24 h，用 82 ℃（溫差100 ℃）的熱水以1∶5 g/ml 的料液比進(jìn)行解凍，再于45 ℃水浴溫度下分別水浴 4、5、6、7、8 h，檢測不同水浴時(shí)間下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計(jì)算最佳水浴時(shí)間條件下的破壁率。

1.3.4 冷凍時(shí)間對山茶蜂花粉破壁的影響。稱取5小袋5 g經(jīng)研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中分別冷凍6、12、24、36、48 h，用 82 ℃（即溫差100 ℃）的熱水以 1∶5 g/ml的料液比進(jìn)行解凍，再于45 ℃水浴溫度下水浴 5 h，檢測不同冷凍時(shí)間下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮，并計(jì)算最佳的冷凍時(shí)間下的破壁率。

1.3.5 水浴溫度對山茶蜂花粉破壁的影響。將5小袋5 g經(jīng)過研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中冷凍 24 h，用 82 ℃（溫差100 ℃）的熱水以 1∶5 的料液比進(jìn)行解凍，再于30、35、40、45、50 ℃這5個(gè)水浴溫度下水浴5 h，檢測不同水浴溫度下蜂花粉的可溶性總糖和游離α.氨基氮的含量，并計(jì)算最佳水浴溫度下的破壁率。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線 試驗(yàn)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2 溫差對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖2可得，選擇 100 ℃ 為適宜溫差。在此溫度下算得可溶性總糖含量為27.8%，游離α.氨基氮的含量為2.86%。在此條件計(jì)算破壁率，在顯微鏡下觀察到山茶蜂花粉?？倲?shù)為46，破壁蜂花粉粒數(shù)為31，由此算得破壁率為67.39%。

圖2 溫差對山茶蜂花粉破壁的影響2.3 料液比對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖3可知，選擇1∶5 g/ml為最佳的料液比。測得可溶性總糖含量為30.59%，游離α.氨基氮含量為2.35%。在顯微鏡下觀察得到花粉?？倲?shù)為51，破壁花粉粒數(shù)為35，算得破壁率為68.63%。

2.4 水浴時(shí)間對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖4可知，選擇5 h為最佳水浴時(shí)間，測得吸光值為0.215，算得可溶性總糖含量為27.1%，游離α.氨基氮含量為2.43%。通過此條件計(jì)算破壁率，在顯微鏡下觀察得到花粉?？倲?shù)為49，破壁花粉粒數(shù)為33，算得破壁率為67.34%。

2.5 冷凍時(shí)間對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖5可知，以冷凍時(shí)間為24 h最佳。在此冷凍條件下，可溶性總糖含量為27.62%，游離α.氨基氮含量為2.35%。通過此條件計(jì)算破壁率，在顯微鏡下觀察得到花粉粒總數(shù)為44，破壁花粉粒數(shù)為30，算得破壁率為68.18%。

2.6 水浴溫度對山茶蜂花粉破壁的影響 由圖6可得，選擇45 ℃為最佳水浴溫度。測得可溶性總糖含量為38.07%，游離α.氨基氮含量為3.02%。通過此條件計(jì)算破壁率，在顯微鏡下觀察得到花粉?？倲?shù)為51，破壁花粉粒數(shù)為35，算得破壁率為68.63%。

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫差、料液比、水浴時(shí)間、冷凍時(shí)間、水浴溫度各因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍，按照表1的因素水平表，選擇L16（53）正交表進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，根據(jù)可溶性總糖、游離α.氨基氮的大小情況，確定檢測溫差破壁的最佳試驗(yàn)條件。結(jié)果分析見表2所示。

從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，試驗(yàn)的最優(yōu)因素水平組合為A2B3C2D2E2，即選擇溫差為100 ℃，料液比為1∶7 g/ml，水浴時(shí)間為5 h，冷凍時(shí)間為24 h，水浴溫度為45 ℃作為接下來進(jìn)一步試驗(yàn)研究的反應(yīng)條件，并測得在此條件下的破壁率為68.75%。

2.8 超聲波時(shí)間對山茶蜂花粉破壁的影響 將以最佳溫差破壁條件處理過的茶花粉進(jìn)行超聲處理，所用儀器為超聲波清洗機(jī)，超聲波功率為220 W，對超聲時(shí)間進(jìn)行單因素考察。

由圖7可得，超聲10 min時(shí)的可溶性總糖含量、游離α.氨基氮含量為最高，隨后逐漸降低并走向穩(wěn)定。所以選擇10 min為最佳超聲波時(shí)間。在此超聲波條件下，可溶性總糖含量為46.08%，游離α.氨基氮含量為3.81%，在顯微鏡下觀察得到破壁蜂花粉粒數(shù)為42，蜂花粉總粒數(shù)為58，算得破壁率為72.41%。

3 結(jié)論

該研究根據(jù)單因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，得出溫差破壁的最佳條件為溫差100 ℃，料液比1∶7 g/ml，水浴時(shí)間5 h，冷凍時(shí)間24 h，水浴溫度45 ℃。然后超聲處理10 min，破壁率為72.41%，可溶性總糖含量為46.08%，游離α.氨基氮含量為3.81%。

通過試驗(yàn)驗(yàn)證，此方法破壁效果比較好，可用于小規(guī)模生產(chǎn)。超聲波輔助技術(shù)是利用朝身邊輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的騷動(dòng)效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)加速物質(zhì)的擴(kuò)散溶解，該技術(shù)的低溫作用有利于保留熱敏成分、成本低、容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。

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責(zé)任編輯 李菲菲 責(zé)任校對 況玲玲