王茜 金毅成

摘要 測(cè)定了天津地區(qū)養(yǎng)殖的彭澤鯽、黃金鯽、烏克蘭鱗鯉、鯉魚(yú)4種共13尾魚(yú)長(zhǎng)度為814 bp的COI部分基因序列，以白鰱、羅非魚(yú)作為外群。利用Mega4.1軟件進(jìn)行序列組成統(tǒng)計(jì)分析、種內(nèi)及種間遺傳距離分析，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ樹(shù)），在NJ樹(shù)上共發(fā)現(xiàn)由不同物種組成的5個(gè)分支，這與傳統(tǒng)的分類學(xué)結(jié)果一致。該研究結(jié)果顯示，COI基因部分序列不但可以作為物種辨識(shí)的良好DNA條碼，而且在鯉科魚(yú)類的種間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析方面也具有一定的適用性。

關(guān)鍵詞 鯉科魚(yú)類；DNA條形碼；分子系統(tǒng)學(xué)；COI基因

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）27-09281-02

Study on DNA Barcoding of Four Common Cyprinidae Fish

WANG Qian， JIN Yicheng

（Tianjin Key Lab of Aquatic Ecology and Aquaculture， Department of Fishery Science， Tianjin Agriculture School， Tianjin 300384）

Abstract The partial COI gene of Pengze crucian carp， gold crucian carp， ukraine scaly carp， carp， silver carp and tilapia fish in Tianjin were studied. 814 bp DNA fragments were obtained and the sequences were analyzed. Statistics of sequence compositions and genetic distance were obtained by using MEGA4.1 software. The phylogenetic tree was also performed by using neighborjoining method. The result showed： the 15 species could be divided into five groups. This is consistent with the results of the taxonomy. And the study indicated that the partial sequence of COI gene was not only a good DNA barcode to identify different species， but also had certain applicability in the analysis of interspecific phylogenetic relationships of Cyprinidae.

Key words Cyprinidae； DNA barcoding； Molecular systems； COI gene

利用DNA條形碼技術(shù)鑒別己知物種和發(fā)現(xiàn)新物種構(gòu)建條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，是目前分子生物學(xué)和分類學(xué)發(fā)展的最新方向^[1-3]。與其他分子標(biāo)記如RFLP、RAPD、基因芯片技術(shù)相比，DNA條形碼具有易于構(gòu)建統(tǒng)一的DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)；重復(fù)性高；使用方便等優(yōu)勢(shì)。2003年在美國(guó)CSHA（The Cold Spring Harbor Asia Conferences）召開(kāi)的全球會(huì)議制定了國(guó)際生命條形碼計(jì)劃（International Barcode of Life projeet）的編定計(jì)劃，并首次將DNA條形碼技術(shù)用于海洋生物的普查研究^[4]。很多國(guó)際組織也自行建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，有較大影響和較大規(guī)模的組織包括FISH-BOL、Canadian Fauna和Birds等。FISH-BOL組織計(jì)劃對(duì)所有魚(yú)類進(jìn)行DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，重點(diǎn)針對(duì)1.5萬(wàn)種海洋魚(yú)類的DNA條形碼，目前己經(jīng)獲得5 000多種魚(yú)類的DNA條形碼數(shù)據(jù)。WARD等^[5]對(duì)澳大利亞207種海洋魚(yú)類進(jìn)行DNA條形碼的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所研究的魚(yú)類都能被COI有效區(qū)分，并認(rèn)為COI基因可以反映這些魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。 LAKRA等^[6]對(duì)印度洋37科79屬115種海洋魚(yú)類進(jìn)行DNA條形碼研究，并證明了種內(nèi)遺傳距離明顯小于種間遺傳距離，從NJ樹(shù)上顯示COI基因可以清楚地反映魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，且與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的分類地位基本吻合，得出該基因可以作為DNA條形碼解決印度魚(yú)類中存在分類模糊的問(wèn)題。彭居俐等^[7]分析了魚(yú)類32尾的COI基因序列，結(jié)果表明，基于COI基因的DNA條形碼在識(shí)別魚(yú)類物種方面與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)基本吻合，且該基因可以探討魚(yú)類種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，認(rèn)為COI基因作為魚(yú)類DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定具有可行性。周佳怡^[8]驗(yàn)證了線粒體COI基因在石斑魚(yú)亞科物種鑒定中的有效性以及DNA條形碼用于石斑魚(yú)亞科的系統(tǒng)發(fā)育分析的可行性。筆者對(duì)4種常見(jiàn)鯉科魚(yú)類DNA條形碼進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究魚(yú)類分子系統(tǒng)以及物種分化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鯉魚(yú)（L）、黃金鯽（H）、彭澤鯽（PJ）、烏克蘭鱗鯉（W）、羅非魚(yú)（LF）、白鰱（BL）采自天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)，用95%的乙醇保存。

1.2 DNA提取

DNA提取采用常規(guī)的苯酚-氯仿法。

1.3 PCR擴(kuò)增

（1）PCR擴(kuò)增的目的片段為COI基因的部分序列，擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[7]，L5956co1：cacaaagacattggcaccct；H6855co1：agtcagctgaakacttttac。

（2）PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系為50 μl，PCR反應(yīng)體系中各組分的量：DNA 1 μl（約100 ng），緩沖液 5 μl（10×），Mg2+ 5 μl（25 mmol/L），引物1和2各2 μl（10 μmol/L），dNTP 1.25 μl（10 mmol/L）， Taq酶 0.4 μl（5 U/μl），水33.35 μl。

（3）PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照。

1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序

選擇條帶明亮、清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在北京華大基因有限公司ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀上完成測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序結(jié)果校正后在NCBI中進(jìn)行相似性搜索，確保所得序列的準(zhǔn)確性。后將15條序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA4.1軟件對(duì)對(duì)比結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)算各樣本之間的遺傳距離（及其標(biāo)準(zhǔn)差），各數(shù)據(jù)組堿基的組成（nucleotide composition）、變異位點(diǎn)（variable sites）、保守位點(diǎn)（conserved sites）、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony information sites）、自裔位點(diǎn)（singleton sites）等。利用Mega 4.1并基于pdistance模式，采用NJ法重復(fù)1 000次分別構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI條形碼序列特征分析

對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行分析，T、C、A、G堿基平均含量分別為28.8%、27.3%、26.3%、176%，顯示G堿基相對(duì)貧乏，其中A+T含量（55.1%）略高于C+G含量（44.9%），即魚(yú)類COI基因表現(xiàn)不明顯的堿基組成偏向性。其中變異位點(diǎn)218個(gè)，保守位點(diǎn)596個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)130個(gè)，自裔位點(diǎn)88個(gè)。分別占整個(gè)序列的2671%、73.04%、15.93%和10.78%。轉(zhuǎn)換位點(diǎn)（66）明顯多于顛換位點(diǎn)（24），轉(zhuǎn)換顛換比2.48，表明基因序列的突變未達(dá)到飽和，適用于系統(tǒng)發(fā)育分析。堿基序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列后，將對(duì)準(zhǔn)后的序列采用MEGA4.1軟件對(duì)每個(gè)樣本mtDNA COII編碼區(qū)的氨基酸組成及密碼子使用頻率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，COI基因816 bp共編碼238個(gè)氨基酸，其中36個(gè)發(fā)生了變異，變異率為15%。由21種氨基酸組成，其中絲氨酸（Ser）、異亮氨酸（Lie）含量最高，平均含量分別為1147%和14.21%。谷氨酸（Glu）含量最低只有1.02%，反映出COI基因在氨基酸組成上有一定的偏向性；同時(shí)通過(guò)各個(gè)序列氨基酸含量分析可知，21種氨基酸在序列中的含量差異不大。

2.2 COI條形碼遺傳距離分析

6個(gè)物種15條COI基因序列基于pdistance模型構(gòu)建的鄰接樹(shù)見(jiàn)圖1。由圖1可知，15個(gè)物種的種內(nèi)平均遺傳距離在0～8.42%，L1、L2與L3種內(nèi)平均遺傳距離較大為1.38%，H1與H2、H3的種內(nèi)平均遺傳距離為1.22%，PJ1與PJ2，PJ3種內(nèi)平均遺傳距離最小為002%。所有魚(yú)類的種間平均遺傳距離為18.23%，顯著大于種內(nèi)平均遺傳距離（0.86%）。

3 討論

（1）該研究表明，序列中沒(méi)有堿基的插入、缺失，T、C、A、G堿基平均含量分別為28.8%、27.3%、26.3%、17.6%，其中A+T含量（55.1%）略高于C+G含量（44.9%），此結(jié)果與周佳怡^[8]研究我國(guó)沿海石斑魚(yú)的DNA條形碼的結(jié)果相似（其結(jié)果為T(mén)、C、A、G堿基平均含量分別為30.2%、276%、243%、17.9%，其中A+T含量54.5%高于C+G含量455%），即魚(yú)類COI基因表現(xiàn)出不明顯的堿基組成偏向性。DESALLE等^[9]指出，在DNA進(jìn)化過(guò)程中，轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率比顛換高的多，這是由于分歧較近的物種間編碼區(qū)DNA序列較多發(fā)生同義突變的結(jié)果，但對(duì)于分歧關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，序列的轉(zhuǎn)換已趨于飽和，堿基替換的形式由以轉(zhuǎn)換為主轉(zhuǎn)向以顛換為主，轉(zhuǎn)換與顛換的比值隨分歧時(shí)間而逐漸變小。HOLMQUIST^[10]認(rèn)為該臨界值約為0.4，該試驗(yàn)堿基轉(zhuǎn)換位點(diǎn)66個(gè)明顯多于顛換位點(diǎn)24個(gè)，轉(zhuǎn)換顛換比（R）2.48，表明基因序列的突變未達(dá)到飽和，適用于系統(tǒng)發(fā)育分析。各個(gè)序列氨基酸含量分析顯示，21種氨基酸在33條序列中的含量差異不大。同時(shí)同義密碼子的使用存在一定的偏倚，且這種現(xiàn)象較普遍，梁菲菲^[11]在密碼子偏性的影響因素及研究意義中有清晰的闡釋。

（2）物種的種內(nèi)差異和種間差異之間存在一個(gè)容易辨認(rèn)的界限，可作為辨別是否屬于同一物種的標(biāo)準(zhǔn)。HEBERT等^[12]認(rèn)為COI基因序列有效地進(jìn)行物種鑒定的關(guān)鍵點(diǎn)在于種間的遺傳距離必須大于種內(nèi)的遺傳距離，即物種的種內(nèi)COI序列的遺傳距離一般小于1%，且距離差異約達(dá)10倍。該研究通過(guò)對(duì)魚(yú)類15個(gè)個(gè)體基于pdistance模型計(jì)算的種內(nèi)平均遺傳距離在0～8.42%，小于1%的占82.43%，小于2%的占94.86%。HEBERT等^[13]對(duì)11個(gè)動(dòng)物門(mén)共計(jì)13 320個(gè)物種進(jìn)行遺傳距離的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)大部分種內(nèi)的遺傳距離小于2%，一般都小于1%，這與該試驗(yàn)結(jié)果相似。GOVINDARAJU^[14]等采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)對(duì)印度洋沿岸7種石斑魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離很近（108%），與該試驗(yàn)結(jié)果一致；種間平均遺傳距離為18.23%，與周佳怡^[8]研究的石斑魚(yú)的結(jié)果（石斑魚(yú)亞科10屬60個(gè)物種共計(jì)381尾樣本的種間的遺傳差異在4.95%～13.47%）相似；HEBERT等^[15]對(duì)北美260種鳥(niǎo)類進(jìn)行COI基因序列測(cè)定結(jié)果顯示，鳥(niǎo)類COI基因序列在屬內(nèi)種間的平均遺傳距離為793%，而種內(nèi)遺傳距離為0.43%。這表明該試驗(yàn)結(jié)果的合理性。

（3）在NJ樹(shù)上共發(fā)現(xiàn)5個(gè)分支顯示不同物種組成，BL和LF作為外群在樹(shù)的基部最早被分開(kāi)，L1、L2與L3聚為一支（支持率為89%、65%）。H1、H2、H3聚為一支（支持率為99%）。PJ1、PJ2、PJ3聚集，且達(dá)到100%。從NJ樹(shù)可以很好地將不同種的魚(yú)類區(qū)分開(kāi)來(lái)。W1與W4關(guān)系較近，構(gòu)成一個(gè)支系（支持率為78%）；W2與W3聚為一支（支持率為84%）。但這2個(gè)分支并沒(méi)有聚成姐妹群，且遺傳距離較大，造成這部分分支混亂的原因有待進(jìn)一步探討。該研究從構(gòu)建的NJ樹(shù)上的部分系統(tǒng)發(fā)育信息可以得出，COI基因是一個(gè)有效的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因，但由于試驗(yàn)測(cè)定的魚(yú)類種類及尾數(shù)偏少，因此需要采用更多分子數(shù)據(jù)，綜合其形態(tài)學(xué)、骨骼學(xué)等資料進(jìn)一步研究，獲得更為真實(shí)的魚(yú)類各屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

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