李其利 黃穗萍 郭堂勛 莫賤友 黃俊斌

摘要 [目的]明確球孢鏈霉菌JK1抗菌物質(zhì)的基本理化性質(zhì)。[方法]以稻瘟菌為指示菌，采用菌絲生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定球孢鏈霉菌JK1發(fā)酵濾液在不同溫度、不同酸堿度、蛋白酶K處理和硫酸銨鹽析之后的抑菌活性；采用硫酸銨鹽析對(duì)抗菌物質(zhì)進(jìn)行初步提純，并通過(guò)超濾的方法初步測(cè)定該抗菌物質(zhì)的分子量大小。[結(jié)果]球孢鏈霉菌JK1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在高溫和蛋白酶K處理的情況下抑菌活性顯著降低，在pH2～11條件下抑菌活性無(wú)顯著變化，而pH≥11的強(qiáng)堿性條件下抑菌活性顯著降低。飽和度為50%的硫酸銨即可將發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)完全沉淀下來(lái)，超濾發(fā)現(xiàn)其分子量在10～30 kD。[結(jié)論]該研究結(jié)果為球孢鏈霉菌的田間應(yīng)用及其抗菌物質(zhì)的分離鑒定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 球孢鏈霉菌；抗菌物質(zhì)；理化特性

中圖分類號(hào) S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）27-09356-03

Study on Physicochemical Property of Antifungal Substances from Streptomyces globisporus JK1

LI Qili1，2， HUANG Suiping1，2，GUO Tangxun1，2 et al

（1.Institute of Plant Protection，Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007；2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，Guangxi 530007）

Abstract [Objective] The aim was to understand basical physicochemical property of antifungal substances from S.globisporus JK1.[Method]Antifungal activity against Magnaporthe oryzae was determined after the culture filtrates of S.globisporus JK1 were treated in various temperatures，pH values，proteinase K or ammonium sulfate precipitation，using the mycelial growth rate method.The antifungal substances were purified priliminarily by ammonium sulfate precipitation，and the range of molecular weight of the antifungal substance was determined with ultrafiltration.[Result] The antifungal activity was significantly lower than control after being treated with high temperature，strong alkalinity （pH≥11） or proteinase K.However，no significant difference was observed when it was treated at the pH ranging from 2 to 11.Ammonium sulfate precipitation could be used to purify the antifungal substances preliminarily，and the molecular weight of the antifungal substance was between 10 kD and 30 kD.[Conclusion]The study result provide a basic for field application and further isolation，purification and identification of the antifungal substances.

Key words Streptomyces globisporus；Antifungal substances；Physicochemical property

鏈霉菌是一類具有廣泛實(shí)際用途和巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微生物類群，廣泛存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境中，種類繁多，代謝功能各異。在目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬(wàn)種微生物來(lái)源的活性物質(zhì)中，超過(guò)50%的都是來(lái)自于鏈霉菌。鏈霉菌可產(chǎn)生種類眾多的農(nóng)用抗生素，而且大多數(shù)已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，可防治真菌、細(xì)菌、線蟲病害以及一些重要害蟲，有的還具有除草活性^[1]。筆者于2007年在培養(yǎng)稻瘟菌的培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)稻瘟病菌有很強(qiáng)拮抗作用的鏈霉菌菌株JK1，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定以及16S rDNA序列分析，將其鑒定為球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus），

其發(fā)酵液對(duì)多種植物病原菌具有很強(qiáng)的拮抗作用，并且對(duì)水稻稻瘟病有較好的防治效果^[2]。

前人的研究主要集中于球孢鏈霉菌及其抗生素的抗腫瘤活性，而很少有關(guān)于其對(duì)植物病原菌的抗菌活性方面的報(bào)道^[3-4]。

然而，球孢鏈霉菌JK1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性等基本理化性質(zhì)尚不清楚，而這些性質(zhì)直接影響著該菌的應(yīng)用范圍和田間效果，也是進(jìn)一步分離提純及鑒定其抗菌物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。為明確該抗菌物質(zhì)的基本理化特性，筆者研究了球孢鏈霉菌JK1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在不同溫度、酸堿度、蛋白酶K、硫酸銨鹽析等方法處理的情況下其抑菌活性的變化，并采用超濾的方法初步測(cè)定了抗菌物質(zhì)分子量的大小，旨在為進(jìn)一步分離提純、結(jié)構(gòu)鑒定和開發(fā)利用該抗菌物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 球孢鏈霉菌JK1由湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)并獲得。

1.2 方法

1.2.1 球孢鏈霉菌發(fā)酵濾液的理化性質(zhì)。

1.2.1.1 球孢鏈霉菌JK1發(fā)酵濾液的制備。

將球孢鏈霉菌JK1劃線接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA，參照方中達(dá)^[5]的方法）培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫光照下培養(yǎng)6 d后，用接種針挑取少量菌落至盛有100 ml 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液（PSB，參照方中達(dá)^[5]的方法）的三角瓶中（250 ml），于25 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)6 d后，將JK1菌體懸浮液（10⁸cfu/ml）按照05%（V/V）的接種量接種到新鮮的PSB培養(yǎng)液中，置于同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 d即為發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心（12 000 r/min，20 min），取上清，用0.45 μm的微孔濾膜真空抽濾后所得濾液即為發(fā)酵濾液。

1.2.1.2 熱穩(wěn)定性。取20 ml發(fā)酵濾液，分別置于25、30、40、50、60、70、80、90、100、110和120 ℃溫度下處理30 min后，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后按10%的比例加入到PDA培養(yǎng)基中，以添加未處理的發(fā)酵濾液（4 ℃保存）和不添加發(fā)酵濾液的PDA平板為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。將直徑5 mm的稻瘟菌菌絲塊接種到PDA平板中央，置于25 ℃下培養(yǎng)10 d后測(cè)量菌落直徑。

抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.2.1.3 酸堿穩(wěn)定性。取20 ml發(fā)酵濾液，分別用5 mol/L HCl和5 mol/L NaOH將樣品pH調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，室溫下放置24 h后，按照“1.2.1.2”方法測(cè)定各處理發(fā)酵濾液的抑菌活性，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.1.4 蛋白酶K處理對(duì)發(fā)酵濾液抑菌活性的影響。

取20 ml發(fā)酵濾液，加入蛋白酶K使其終濃度為100 μg/ml，置于37 ℃下分別水浴30、60、90、120 min后，按照“1.2.1.2”方法測(cè)定各處理發(fā)酵濾液的抑菌活性，以未添加蛋白酶K的發(fā)酵濾液為對(duì)照。

1.2.1.5 硫酸銨鹽析后不同組分的抑菌活性測(cè)定。

（1）硫酸銨鹽析。取20 ml發(fā)酵濾液，加入固體硫酸銨至飽和度（M/V）分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。4 ℃靜置過(guò)夜后，10 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀物，并置于4 ℃冰箱內(nèi)用0.02 mol/L磷酸緩沖液透析48 h測(cè)定抑菌活性。

（2）抑菌活性測(cè)定。將滅菌的濾紙片（直徑5 mm）置于涂有稻瘟菌孢子液的PDA平板上（直徑15 cm），無(wú)菌風(fēng)吹干至培養(yǎng)基表面無(wú)明顯水分。然后將不同處理的沉淀透析液和上清透析液用孔徑為0.45 μm的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，分別用微量移液器添加至濾紙片上，每片20 μl。以在濾紙片上添加等量的未處理粗提物、相同硫酸銨飽和度鹽析處理的PSB培養(yǎng)液和磷酸緩沖液為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.2 抗菌物質(zhì)粗提物的基本性質(zhì)。

1.2.2.1 抗菌物質(zhì)粗提物的制備。

將“1.2.1.1”所述發(fā)酵濾液用飽和度為80%的硫酸銨4 ℃沉淀過(guò)夜，于 4 ℃、10 000 r/min離心30 min收集沉淀。將沉淀用發(fā)酵濾液1%體積的0.02 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.8）溶解，置于4 ℃冰箱內(nèi)用0.02 mol/L磷酸緩沖液透析48 h，冷凍干燥后-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 熱穩(wěn)定性。

將粗提物溶解于0.02 mol/L磷酸緩沖液中配制成濃度為10 mg/ml的溶液，取1 ml溶液分別置于40、50、60、70、80、90、100、110、120 ℃溫度下處理30 min，以未處理的粗提物和磷酸緩沖液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。按照“1.2.1.5”方法測(cè)定不同溫度處理粗提物對(duì)稻瘟菌的抑菌活性。

1.2.2.3 蛋白酶K對(duì)粗提物抑菌活性的影響。

取磷酸緩沖液溶解的粗提物（10 mg/ml）1 ml，添加蛋白酶K至終濃度為100 μg/ml，置于37 ℃下分別水浴30、60、90、120 min，細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后按照“1.2.1.5”方法測(cè)定各處理粗提物對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性，以未處理的粗提物和磷酸緩沖液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2.4 抗菌物質(zhì)分子量的初步測(cè)定。

取磷酸緩沖液溶解的粗提物（10 mg/ml）各15 ml，分別加入截留分子量為10 和30 kD的超濾離心管中（Millipore，裝量15 ml），在5 000 r/min、4 ℃下離心15 min，分別收集過(guò)濾液與殘留物，并按照“1.2.1.5”方法測(cè)定各處理濾液和殘留物對(duì)稻瘟菌的抑菌活性。以未過(guò)濾的發(fā)酵濾液和磷酸緩沖液為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理。用DPS3.01專業(yè)版軟件分析不同溫度、pH、蛋白酶K、硫酸銨沉淀、超濾對(duì)球孢鏈霉菌JK1產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響，百分率數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成反正弦值并用最小顯著差數(shù)法（LSD）比較不同處理的差異顯著性。用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢鏈霉菌JK1發(fā)酵濾液的理化性質(zhì)

2.1.1 熱穩(wěn)定性。

結(jié)果表明，發(fā)酵濾液在4～30 ℃溫度下處理30 min其抑菌活性差異不顯著（圖1）。高于40 ℃的溫度處理其抑菌活性與對(duì)照相比顯著降低。在120 ℃溫度下處理30 min，其抑菌活性雖與對(duì)照相比顯著降低，但是發(fā)酵濾液仍然具有明顯的抑菌活性，抑菌率可達(dá)58%。

3 結(jié)論與討論

前人研究表明，球孢鏈霉菌在低溫（≤15 ℃）培養(yǎng)的情況下可產(chǎn)生一類多肽類抗生素——冷霉素，并且發(fā)現(xiàn)最適于冷霉素產(chǎn)生的溫度是12 ℃^[6-7]。在中等溫度下（15～30 ℃），球孢鏈霉菌可產(chǎn)生水溶性的抗生素——力達(dá)霉素、M81和溶菌酶等^[7-9]。對(duì)球孢鏈霉菌JK1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在高于40 ℃的溫度下處理或蛋白酶K處理的情況下其抑菌活性均呈下降趨勢(shì)，且可被硫酸完全沉淀下來(lái)，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)為蛋白類抗生素，可通過(guò)硫酸銨鹽析進(jìn)行初步提純?？咕镔|(zhì)在酸性和中性條件下穩(wěn)定，而在強(qiáng)堿性條件下（pH≥11）活性顯著降低。超濾的結(jié)果表明，JK1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的分子量在10～30 kD。這與前人報(bào)道的球孢鏈霉菌產(chǎn)生的蛋白類抗生素力達(dá)霉素的分子量（15 kD）較接近。然而，前人的研究多集中于球孢鏈霉菌產(chǎn)生抗腫瘤活性的抗生素方面，而對(duì)其產(chǎn)生的對(duì)植物病害有較好防治效果的抗菌物質(zhì)的研究較少[3，10]。筆者初步研究了球孢鏈霉菌產(chǎn)生的對(duì)多種植物病原菌有拮抗作用的抗菌物質(zhì)的理化特性，為該菌的田間應(yīng)用提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為分離鑒定其抗菌物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

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