王遂 趙慧 李墨野 姜靜

摘要 [目的]初步比較二、三、四倍體白樺葉芽中IAA和ABA含量的差異，為研究植物內(nèi)源激素在不同倍性白樺生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用提供參考。[方法] 利用HPLC法測定了二、三、四倍體白樺葉芽中IAA和ABA含量。[結(jié)果]對不同倍性白樺葉芽IAA與ABA含量的比較發(fā)現(xiàn)，多倍體白樺葉芽IAA含量均顯著高于二倍體，而ABA含量則顯著低于二倍體；單位質(zhì)量的二、三、四倍體白樺葉芽中IAA/ABA的值分別為0.76、1.45、1.06。[結(jié)論] 染色體倍數(shù)的增加對內(nèi)源激素含量產(chǎn)生了重要影響。

關(guān)鍵詞 多倍體；白樺；吲哚3乙酸；脫落酸；高效液相色譜

中圖分類號(hào) S792.153 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）27-09418-03

Analysis of IAA and ABA in Leaf Buds of Different Ploidy Betula platyphylla Suk.

WANG Sui， ZHAO Hui， LI Moye， JIANG Jing*

（National Key Laboratory of Forest Tree Genetic Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To compare differences of IAA and ABA in leaf buds of diploidy， triploidy and tetraploidy white birches， which will provide reference for studying the role of plant endogenous hormone in growth and development process of Betula platyphylla Suk.. [Method] HPLC method was adopted to determine IAA and ABA content in leaf buds of Betula platyphylla Suk.. [Result] The comparison results of IAA and ABA content in leaf buds of different ploidy Betula platyphylla Suk. showed that the IAA was significantly higher and the ABA was significantly lower in the polyploidy than those in the diploidy， respectively. Ratios of IAA/ABA in diploidy， triploidy and tetraploidy Betula platyphylla Suk. were 0.76， 1.45， 1.06. [Conclusion] The result demonstrated that chromosome doubling has a significant impact on the content of endogenous phytohormone.

Key words Polyploid； Betula platyphylla Suk.； IAA； ABA； HPLC

白樺（Betula platyphylla Suk.）是樺木科樺木屬植物，落葉喬木或灌木，主產(chǎn)北半球寒溫帶、溫帶地區(qū)，抗性極強(qiáng)，對土壤適應(yīng)性廣，生長快，耐干旱貧瘠，是我國北方最重要的經(jīng)濟(jì)和園林綠化樹種之一^[1]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期利用秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生白樺四倍體后，又通過與白樺二倍體雜交，獲得白樺三倍體雜種。初步研究發(fā)現(xiàn)，三、四倍體與二倍體白樺相比，高生長變化不大，徑生長明顯增加，苗木整體呈現(xiàn)出粗壯的變化趨勢。目前吲哚3乙酸（IAA）與脫落酸（ABA）等植物內(nèi)源激素在不同倍性白樺生長發(fā)育中所發(fā)揮的作用尚不清楚。

該試驗(yàn)利用高效液相色譜法（HPLC）檢測白樺二、三、四倍體葉芽中IAA和ABA的含量，旨在初步比較3種不同倍性白樺葉芽中IAA、ABA的含量差異，為研究植物內(nèi)源激素在不同倍性白樺生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 供試材料。

2014年4月25日上午，在東北林業(yè)大學(xué)林木育種基地，分別取一定量的二倍體、三倍體和四倍體9年生中國白樺生長健壯的葉芽若干，迅速放入液氮中冷卻后，儲(chǔ)存在-80 ℃超低溫冰箱保存待用。

1.1.2 主要試劑。

IAA為HPLC用標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)）；ABA為HPLC用標(biāo)準(zhǔn)品（美國SIGMA公司生產(chǎn)）；色譜級(jí)甲醇（美國Fisher Scientific公司生產(chǎn)）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）；其余試劑均為分析純，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器。

Waters高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 600 四元泵，Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱和Waters 2996 二極管陣列檢測器，Empower 3.0 色譜分析系統(tǒng)），Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm 5.0 μm），SepPak C18固相萃取柱（3cc），均由美國Waters公司生產(chǎn)；TissueLyser II樣品破碎系統(tǒng)（德國Qiagen公司生產(chǎn)）；離心機(jī)和Concentrator plus 真空離心濃縮儀（由德國Eppendorf公司生產(chǎn)）。

1.2 研究方法

1.2.1 色譜條件。

流動(dòng)相：A.甲醇，B.水（含0.1%冰乙酸）；

洗脫程序見表1。

脫氣：氦氣在線脫氣；

柱溫：30 ℃；

進(jìn)樣量：20 μl；

檢測波長：IAA為218.7 nm，ABA為262.2 nm；

進(jìn)樣延遲：5 min；

運(yùn)行時(shí)間：30 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2.1 母液的配制。

取0.100 0 g植物內(nèi)源激素，用HPLC級(jí)甲醇定容在100 ml容量瓶中，配制成濃度為1 mg/ml的母液。

1.2.2.2 單標(biāo)儲(chǔ)備液的配制。

取1 ml激素母液，用HPLC級(jí)甲醇定容在100 ml容量瓶中，配制成濃度為1×10-2 mg/ml的單標(biāo)儲(chǔ)備液。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。

利用微量移液器，將不同體積的單標(biāo)儲(chǔ)備液加入容量瓶中，用HPLC級(jí)甲醇定容，配制成2種溶質(zhì)終濃度均為1×10-2、5×10-3、2.5×10-3、1×10-3、5×10-4、2.5×10-4、1×10-4、5×10-5、2.5×10-5與1×10-5 mg/ml的不同標(biāo)準(zhǔn)工作液，并依次命名為標(biāo)準(zhǔn)工作液①～⑩。

1.2.3 樣品前處理方法。

參照前人的相關(guān)方法，進(jìn)一步改進(jìn)方案為^[2-5]：

（1）準(zhǔn)確稱取白樺葉芽1 g（FW），迅速放入-80 ℃超低溫冰箱待用。

（2）將儲(chǔ)存的白樺葉芽置于球磨機(jī)中，加入液氮冷卻后，在28 Hz頻率下研磨0.5 min，至樣品變?yōu)闃O細(xì)粉末，放入錫紙包好的50 ml大試管中。

（3）向大試管中加入5 ml冷的含80%甲醇，20%水的提取液。

（4）超聲波冰浴振蕩60 min。

（5）6 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液。

（6）收集沉淀，再用5 ml冷80%甲醇提取液提取1次，重復(fù)步驟（3）～（5）。

（7）合并2次提取液，在真空離心濃縮儀中減壓濃縮至只剩水相。

（8）加入5 ml，pH=8.0的PBS（磷酸鹽緩沖液）。

（9）加等體積石油醚，萃取3次，棄去有機(jī)相。

（10）加0.5 mol/L檸檬酸，調(diào)pH至2.8～3.0。

（11）加等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，減壓濃縮至干。

（12）用2 ml，pH=8.0的PBS（磷酸鹽緩沖液）溶解。

（13）過SepPak固相萃取柱（需先用3 ml 100%甲醇活化，再用3 ml pH=3.0的去離子水平衡），過柱流速均為1 ml/min。

（14）用1 ml pH=3.0的去離子水作為淋洗液淋洗。

（15）用含0.1%冰乙酸的80%甲醇為洗脫液洗脫，收集洗脫液。

（16）接取洗脫后的餾分，經(jīng)0.45 μm的濾器過濾，減壓濃縮至干，用100%甲醇（色譜純）定容，儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中，備用進(jìn)樣。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法。

利用Empower 3.0、SPSS 20.0和Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將制作好的標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)樣，每1標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，根據(jù)兩者之間的線性相關(guān)性，用Empower 3.0軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表2）。結(jié)果可以看出，兩者線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R²均大于0.99。

2.2 精密度和穩(wěn)定性

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液⑤20 μl，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積積分值。結(jié)果表明，3次進(jìn)樣后峰面積積分值變化不大，IAA與ABA對應(yīng)峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（R.S.D）均小于0.2%，精密度符合要求。

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液⑤20 μl，于配置后的0、6、12、24和48 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積積分值。結(jié)果顯示，IAA與ABA 2種植物內(nèi)源激素在甲醇溶液中穩(wěn)定性良好，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（R.S.D）均小于0.6%，在試驗(yàn)需要的時(shí)間范圍內(nèi)，具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 回收率

向已知IAA和ABA含量的葉芽樣品中分別加入10 000 ng的IAA和ABA標(biāo)準(zhǔn)品，用上文所述樣品前處理方法處理，計(jì)算回收率，重復(fù)3次（表3）。結(jié)果表明，IAA和ABA 2種物質(zhì)在復(fù)雜的前處理過程中有部分損失。故在計(jì)算完成樣品中2種物質(zhì)的含量后需要一個(gè)校正系數(shù)將測定值轉(zhuǎn)換成一個(gè)更接近真實(shí)值的數(shù)值，根據(jù)兩者的平均回收率，將IAA的校正系數(shù)定為1.35，ABA的校正系數(shù)為1.29。

果發(fā)現(xiàn)，普通二倍體白樺葉芽中IAA含量最低，ABA最高；三倍體的IAA含量最高；四倍體的ABA含量最低。單位質(zhì)

量的二、三、四倍體白樺葉芽中IAA/ABA的值分別為0.76、

1.45、1.06。對原始計(jì)算結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析顯示，不同倍性白樺葉芽中IAA含量差異極顯著（P<0.01），ABA含量差異顯著（P<0.05）。進(jìn)一步的多重比較表明（Duncan法，α=0.05），不同倍性白樺葉芽之間IAA含量差異均顯著；而ABA只在二倍體與多倍體之間差異顯著。

3 結(jié)論與討論

人們對多倍體的研究已有很長的歷史，多倍體植株常較普通二倍體生長發(fā)育緩慢，開花成熟晚，含水量高，滲透壓低，植物組織內(nèi)碳水化合物、維生素、蛋白質(zhì)、葉綠素和一部分次生代謝產(chǎn)物含量顯著升高^[6]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，多倍體白樺與二倍體白樺相比，在胸徑、葉片、氣孔和果序方面明顯增大。這些特點(diǎn)與內(nèi)源激素含量的變化有著很大關(guān)系^[7]。對于單個(gè)或多個(gè)基因的多拷貝，有時(shí)會(huì)對內(nèi)源激素產(chǎn)生重要影響，而其影響大小與插入基因拷貝數(shù)的多少關(guān)系不大。就吲哚3乙酸而言，即使插入的是其合成相關(guān)基因，也不能保證最終IAA表達(dá)的含量一定上升，這可能與基因的共抑制或插入位點(diǎn)不同有關(guān)^[8-10]。但關(guān)于多倍體植株，尤其是木本植物內(nèi)源激素的報(bào)道尚不多見。一般認(rèn)為，隨著染色體倍數(shù)的增加，部分植物內(nèi)源激素的含量會(huì)有所上升，而上升的比例與染色體增加的倍數(shù)并無多大關(guān)

聯(lián)^[11]。但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，有時(shí)內(nèi)源激素也會(huì)隨著染色體倍

數(shù)的增加而降低^[12]。從此次試驗(yàn)的結(jié)果看，三、四倍體葉芽中IAA的含量明顯高于二倍體，而ABA含量低于二倍體。觀察三者的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，三、四倍體葉芽的體積大，單個(gè)葉芽的質(zhì)量也重，但芽的數(shù)量少；二倍體葉芽體積小，單芽質(zhì)量

輕，而芽的數(shù)量多，這可能與植物內(nèi)源激素含量和互作的變化有很大關(guān)聯(lián)。通過對四倍體和二倍體白樺基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析也發(fā)現(xiàn)，在IAA合成途徑中，四倍體較二倍體共有11個(gè)差異基因，全部上調(diào)表達(dá)，這從分子角度初步闡釋了多倍體白樺IAA含量上升的機(jī)理。由于材料的限制，該試驗(yàn)的樣本數(shù)較少，其測定結(jié)果是否具有普遍性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證；同時(shí)，由于多倍體的復(fù)雜性，染色體倍數(shù)的增加與內(nèi)源激素含量的變化關(guān)系十分復(fù)雜，因此從不同角度對其進(jìn)行研究闡述亦具有重要意義。

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