饒勝其 曾化偉 方維明

摘要

[目的]篩選能高產(chǎn)AMP脫氨酶的野生菌株，并對該菌株進(jìn)行菌種鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化。[方法] 通過大豆的自然發(fā)酵制備豆豉曲，并分別以PDA、MRS和YPD 3種培養(yǎng)基進(jìn)行豆豉曲中微生物的分離純化，將獲得的分離菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并檢測發(fā)酵液的AMP脫氨酶活力。[結(jié)果]試驗通過3種培養(yǎng)基分離純化，獲得純種菌株51株。通過進(jìn)一步的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，檢測到具有AMP脫氨酶活性的菌株為16株，選取活性最高的DCP23菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)分析，初步鑒定該菌株為青霉菌屬。通過搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，確定該菌株產(chǎn)酶的適宜發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH 為6.0，接種量為6%，30 ℃發(fā)酵60 h。在上述發(fā)酵條件下，發(fā)酵液中的AMP脫氨酶可達(dá)到293.7 U/ml。[結(jié)論]試驗獲取了1株能產(chǎn)較高活性AMP脫氨酶的野生青霉菌株DCP23，可為高產(chǎn)AMP脫氨酶的菌株研究提供參考。

關(guān)鍵詞 AMP脫氨酶；自然發(fā)酵；豆豉曲；菌株篩選

中圖分類號 S609.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）27-09532-05

Study on Screening and Incubation Condition of AMP DeaminaseProducing Strains in Douchiqu from Soybeans Natural Fermentation

RAO Shengqi¹， ZENG Huawei²， FANG Weiming1*

（1. School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127； 2. Jiangsu Alphay BioTechnology Co. Ltd.， Nantong， Jiangsu 226009）

Abstract [Objective] To screen out wild strains for producing AMP deaminase， the strain identification and fermentation conditions optimization were conducted. [Method] Through natural fermentation of soybean to prepare Douchiqu， three culture mediums PDA， MRS and YPD were used to conduct separation and purification of microorganism in Douchiqu. The liquid fermentation culture was conducted on the obtained isolated strains， and the AMP deaminase activity was detected. [Result] The strains from Douchiqu were purified respectively with PDA， MRS and YPD medium， and then 51 pure strains in total were obtained. Through further fermentation culture with shake flask， 16 strains among them with AMP deaminase activities were detected. The colony morphology and mycelium morphology analysis of DCP23 with the highest activity were conducted， and this strain was preliminary identified as penicillium. Through optimization of fermentation condition， the suitable condition for enzyme production was as followed： initial pH value of 6.0， inoculation amount of 6%， fermentation of 60 h at 30 ℃. Under the above conditions， the AMP deaminase activity in the fermentation broth could reach 293.7 U/ml. [Conclusion] DCP23 was obtained， which can provide reference for study on strains producing high yield of AMP deaminase.

Key words AMP deaminase； Natural fermentation； Douchiqu； Strain screening

腺苷酸脫氨酶（AMP deaminase ，EC 3.5.4.6）是氨基水解酶的一種，它能夠定量脫去腺苷酸嘌呤堿基上的氨基，生成肌苷酸IMP 和NH₃^[1]。AMP 脫氨酶是構(gòu)成嘌呤核苷酸代謝循環(huán)的3種主要酶類之一，它對維持體內(nèi)腺苷酸能荷和機(jī)體免疫力有重要作用^[2-3]。AMP脫氨酶最大用途是酶解腺苷酸生成IMP用于生產(chǎn)強(qiáng)力味精，它還是核酸酶解法生產(chǎn)呈味核苷酸的重要酶類之一。此外，AMP脫氨酶還可用于生產(chǎn)細(xì)胞的H+緩沖劑^[4-5]。目前，AMP脫氨酶主要采用動物組織抽提法和微生物發(fā)酵法進(jìn)行制備。直接提取法生產(chǎn)成本較高，不適合于工業(yè)化大生產(chǎn)，但可用于科研^[6-7]。現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中使用的酶大都由酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物發(fā)酵制備，國內(nèi)已有通過微生物發(fā)酵產(chǎn)AMP脫氨酶的報道[5，8-10 ]。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)AMP 脫氨酶，操作簡便，易于工業(yè)放大，生產(chǎn)成本低，可作為AMP脫氨酶生產(chǎn)的主要途徑。但是，目前用于制備AMP脫氨酶的菌株資源有限，因此非常有必要從自然界篩選能高產(chǎn)AMP 脫氨酶的野生菌株及其基因資源。

豆豉，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在制曲過程中，豆豉曲表面會集聚豐富的微生物，有乳酸菌、酵母菌和霉菌^[11-12]。筆者依據(jù)自然發(fā)酵豆豉曲中富集的主要微生物，采用3種固體培養(yǎng)基（YPD、PDA、MRS）對豆豉曲中的野生菌株進(jìn)行分離純化，將獲得的分離菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并檢測發(fā)酵液的AMP脫氨酶活力，以篩選能高產(chǎn)AMP脫氨酶的野生菌株，并對該菌株進(jìn)行菌種鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基。試驗菌株均從自然發(fā)酵豆豉曲中篩選得到。

PDA液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml，121 ℃滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，K₂HPO₄2 g，檸檬酸氫二銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 ml，MgSO₄·7H₂O 0.58 g，MnSO₄0.25 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 ml，調(diào)節(jié)pH至62～6.4，121 ℃滅菌20 min。

YPD液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 ml，調(diào)節(jié)pH至50～5.5，121 ℃滅菌20 min。PDA固體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基和YPD固體培養(yǎng)基均為在各自液體培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上各加20 g瓊脂而制成。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備。

主要試劑：除腺苷酸AMP為sigma公司外，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：DH2C大容量恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；UV7504紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；pico17微量臺式離心機(jī)，美國Thermo公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SX500高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMMY公司；DGX 9053B2 生化培養(yǎng)箱，上海?，斣囼炘O(shè)備有限公司；ZHJH C1209B垂直流超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 自然發(fā)酵豆豉曲的制備。

將500 g黃豆經(jīng)過清洗、瀝干、蒸煮、冷卻和自然接種后，于室溫（約25～30 ℃）自然發(fā)酵，48 h后進(jìn)行翻曲，放置5 d左右即可得到菌絲密度的豆曲，此時的豆豉曲即可用于篩選菌株。

1.2.2 產(chǎn)AMP脫氨酶菌株的篩選。

1.2.2.1 菌樣獲取。從豆豉曲上選取微生物菌落特征差別較大的多個點，分別稱取樣品2 g加入裝有90 ml無菌水和玻璃珠的三角瓶中，室溫振蕩30 min使樣品充分打散，靜置獲得樣品懸液。

1.2.2.2 菌株分離。樣品懸液梯度稀釋后均勻涂布于初篩平板YPD、PDA和MRS上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，選擇涂布濃度適宜的平板，以菌落生長分開，形態(tài)完整為宜，從平板中挑取生長單獨的菌落分別進(jìn)行劃線，培養(yǎng)，重復(fù)劃線培養(yǎng)操作至少3次。對于YPD平板上的特征菌株，也可以針對性地用PDA和MRS平板進(jìn)行選擇性劃線分離，其他平板類似。最終從各自篩選平板上得到純種的菌株。

1.2.2.3 搖瓶培養(yǎng)。將YPD、PDA和MRS平板上分離得到的純種菌株分別采用相應(yīng)液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，250 ml三角瓶裝液50 ml。將MRS平板上分離得到的純種菌株進(jìn)行活化后，按體積分?jǐn)?shù)2%接種于新鮮MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng) 50 h；將YPD平板上分離得到的純種菌株進(jìn)行活化后，按體積分?jǐn)?shù)2%接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h；將PDA平板上篩選得到的菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基，待孢子形成后，用無菌水制備菌種孢子懸液 （10⁶～10⁷個/ml）。取 2 ml 孢子懸液轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.2.4 酶樣制備及酶活測定。搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)液以 8 000 r/min離心 20 min，取上清液，即為酶樣。酶活參照劉軍昌等的方法進(jìn)行測定^[13]。具體步驟如下：移取3 ml反應(yīng)底物（3.5×10-2 g/L）于37 ℃保溫5 min，加入稀釋后的酶樣0.1 ml，反應(yīng)15 min后加入3 ml 10%的高氯酸溶液終止反應(yīng)。對照樣品方法同上，反應(yīng)底物保溫后，先后加入3 ml 10%的高氯酸溶液和0.1 ml的酶樣。反應(yīng)結(jié)束后，在波長265 nm處，用石英比色皿，以水為參比測量吸光度。酶活定義：在上述條件下1 min吸光值改變0.001，定義為1個酶的活力單位（U）。

1.2.3 霉菌菌種鑒定。

1.2.3.1 菌落形態(tài)觀察。將分離純化后的DCP23，接種于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，以觀察其菌落形態(tài)。具體步驟為：在倒好培養(yǎng)基平皿中，用接種針從斜面挑取少許孢子在培養(yǎng)皿中按三角頂點位置三點式接種。PDA培養(yǎng)基平皿在30 ℃下培養(yǎng)3～5 d。形成巨大菌落后進(jìn)行特征觀察并記錄。

1.2.3.2 菌絲形態(tài)觀察。于清潔的載玻片上，分別加乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液和滅菌生理鹽水，用牙簽從培養(yǎng)基平皿菌落邊緣挑取少量孢子的菌絲或直接取少許發(fā)酵培養(yǎng)液置于上述液體中，然后小心蓋上蓋玻片，以防止產(chǎn)生氣泡。用火柴棒輕輕敲擊蓋玻片表面使菌落分散，然后置于顯微鏡觀察菌絲，于放大倍數(shù)7 000倍數(shù)下觀察菌絲產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 發(fā)酵條件對DCP23產(chǎn)酶的影響。用無菌水制備孢子懸浮液，血球計數(shù)，控制孢子濃度為1.0×10⁸個/ml。分別考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量和培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.1 發(fā)酵溫度對DCP23產(chǎn)酶的影響。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為7.0，接種量為3%，分別在24、26、28、30、32、35 ℃的溫度下，180 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h，依據(jù)“1.2.2”測定培養(yǎng)液上清的酶活力。

1.2.4.2 發(fā)酵時間對DCP23產(chǎn)酶的影響。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為7.0，接種量為3%，30 ℃，180 r/min，分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84和96 h，依據(jù)“1.2.2”測定培養(yǎng)液上清的酶活力。

1.2.4.3 接種量對DCP23產(chǎn)酶的影響。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為7.0，接種量分別為3%、6%、9%、12%和15%，30 ℃溫度下，180 r/min，振蕩培養(yǎng)60 h，依據(jù)“1.2.2”測定培養(yǎng)液上清的酶活力。

1.2.4.4 培養(yǎng)基初始pH對DCP23產(chǎn)酶的影響。分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，在接種量6%，30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)60 h，依據(jù)“1.2.2”測量培養(yǎng)液上清的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆豉曲菌株的分離純化

如圖1所示，經(jīng)過為期5 d的自然發(fā)酵，黃豆表面生長的微生物已十分旺盛，在不同位置長有菌落形態(tài)特征各異的菌株，有紅色、紫色、白色、青黑色等顏色，且有的菌落較為光滑緊致，有的菌落呈絮狀或發(fā)散狀，各不相同。選取具有明顯菌落特征的8個取樣點進(jìn)行取樣，見圖1b中的A～H點。

逐一挑取PDA、MRS和YPD平板上的特征菌落（圖2），經(jīng)過連續(xù)劃線分離和培養(yǎng)，共計得到單一菌株51株，分別從PDA、MRS和YPD平板上各得到25株、9株和17株。PDA平板分離株依次編號為DCP01～DCP25，MRS平板分離株依次編號為DCM01～DCM09，YPD平板分離株依次編號為DCY01～DCY17。

2.2 產(chǎn)AMP脫氨酶菌株的篩選

將PDA、MRS和YPD平板上分離得到的純種菌株分別采用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基按照“1.2.2”的條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵終止后，收集培養(yǎng)液上清，進(jìn)行AMP脫氨酶酶活測定。試驗結(jié)果如表1所示，具有AMP脫氨酶酶活的菌株共計16株，多數(shù)為PDA平板分離株和YPD平板分離株，其中編號為DCP23的菌株酶活最高，達(dá)到293.7 U/ml。初步確定DCP23為此批次試驗的AMP脫氨酶最高產(chǎn)菌株，故選取DCP23進(jìn)行下一步的菌種鑒定及適宜發(fā)酵條件考察。

3 結(jié)論

通過自然發(fā)酵豆豉曲的制作、豆豉曲微生物的分離純化、AMP脫氨酶酶活檢測、高產(chǎn)脫氨酶菌株的鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化，該研究獲取了1株能產(chǎn)較高活性AMP脫氨酶的野生青霉菌株DCP23，其適宜發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH 6.0，接種量6%，30 ℃發(fā)酵60 h。該條件下DCP23發(fā)酵液的酶活力達(dá)到293.7 U/ml。該菌株產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基有待進(jìn)一步的優(yōu)化，其所產(chǎn)AMP脫氨酶的酶基因也有待進(jìn)一步的挖掘。

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