王慧春 王劼 王思文 王文穎

（青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青海西寧 810008）お

摘要 ［目的］探究獨一味組培快繁技術(shù)體系，保護(hù)并合理利用獨一味資源。［方法］選取獨一味無菌苗的子葉、嫩芽和幼根為外植體，采用不同類型的培養(yǎng)基和不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行組培快繁研究。［結(jié)果］獨一味幼葉、嫩芽和幼根均可誘導(dǎo)出愈傷組織，其中幼根的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)93.5%，出愈時間為7 d，最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS＋1.0 mg/L 2，4睤+0.5 mg/L 6睟A＋0.5 mg/L NAA；叢生芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為 MS＋1.0 mg/L 6睟A＋0.5 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)88.8%；生根的適宜培養(yǎng)基為 1/2 MS＋0.5 mg/L NAA，誘導(dǎo)率高達(dá)97.9%。［結(jié)論］利用組織培養(yǎng)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)獨一味的快速繁殖，為獨一味資源的可持續(xù)利用提供參考。

關(guān)鍵詞 獨一味［獿amiophlomis rotata（Benth.）Kudo］；組織培養(yǎng)；愈傷組織；植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號 SB567.239文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06133-03

お

Research on the Tissue Culture of 獿amiophlomis rotate (Benth.) Kudo

WANG Hui瞔hun et al

(College of Life and Geography, Qinghai Normal University, Xining, Qinghai 810008)

Abstract ［Objective］ It is of significance to establish tissue culture system of 獿amiophlomis rotata(Benth.) Kudo in order to rationally protect and utilize its resources. ［Method］ The cotyledons, tender shoots and tender roots of the aseptic seedling as explants were cultured in the media with different plant growth regulators to find out more reasonable medium formula for the induction of callus, cluster buds and rooting. ［Results］ The tender roots were the optimal explants with the highest callus induction rate（93.5%）and the shortest induction time (7 d), and the best medium for callus induction was MS＋1.0 mg/L 2,4睤+0.5 mg/L 6睟A＋0.5 mg/L NAA; The optimal medium for cluster buds induction was MS＋1.0 mg/L 6睟A＋0.5 mg/L NAA, induction rate was 88.8%; The optimal medium for rooting culture was 1/2 MS＋0.5 mg/L NAA, in which the frequency roots reached 97.9%. ［Conclusion］ This effective approach for rapid propagation would better ensure the sustainable use of 獿amiophlomis rotata(Benth.) Kudo.

Key words 獿amiophlomis rotata(Benth.) Kudo; Tissue culture; Callus; Plant growth regulator

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基金項目 國家自然科學(xué)基金項目(31260127)；教育部科學(xué)技術(shù)重點項目（209133）；青海省科技廳國際合作項目（2010睭809）；青海師范大學(xué)科技創(chuàng)新項目（019040910）；青海師范大學(xué)教學(xué)研究項目（20123626）。

作者簡介 王慧春（1974-）,女,青海海東人，副教授,博士,從事青藏高原藥用植物資源的可持續(xù)利用研究。

收稿日期 20140605

獨一味［獿amiophlomis rotata（Benth.）Kudo］為唇形科獨一味屬僅有的一種植物，是多年生草本植物，全草入藥，是我國藏、蒙、納西等民族民間常用草藥之一，具有較高的藥用價值與經(jīng)濟(jì)價值［1-2］。獨一味野生資源主要分布于青海、甘肅、四川、西藏等地，蘊(yùn)藏量為3 713~6 896 t，年允收量為908~1 675 t，但年實際采收量為 2 520 t；獨一味采挖地上部分之后，恢復(fù)到藥用價值的周期一般為4年，高海拔地區(qū)在5年以上，使該資源的利用變得不可持續(xù)［3］。很多采挖過度的產(chǎn)地，植株極其矮小，加之草地退化與沙化，導(dǎo)致獨一味資源種群退化相當(dāng)嚴(yán)重，野生撫育尚存在諸多困難［4］。2000年已將其列為一級瀕危藏藥品種［5］。因此，為了滿足人們對獨一味藥材日益增長的需求，在加強(qiáng)野生資源保護(hù)的前提下，應(yīng)加強(qiáng)人工繁殖，組織培養(yǎng)則是當(dāng)前最有效的繁殖手段［6-7］。筆者初步探討?yīng)氁晃督M織培養(yǎng)條件，旨在為獨一味的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 將采自青海果洛地區(qū)的野生獨一味［獿amiophlomis rotate（Benth.）Kudo］種子用 0.2%升汞滅菌8 min，用無菌水反復(fù)沖洗后，接種到MS無激素培養(yǎng)基上。培養(yǎng)3周后長出無菌幼苗。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基（pH 5.8）在 121 ℃、131 kPa 的條件下滅菌 20 min。光源為日光燈，光照強(qiáng)度設(shè)置為2 000~3 000 lx，光照16 h/d，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，在RXZ 智能人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 基本培養(yǎng)基和外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。在無菌條件下，將無菌苗幼葉切成約 0.5 cm×0.5 cm 的小塊，嫩芽和幼根切成0.5 cm 的切段，分別接種在附加有0.5 mg/L 6睟A，1 mg/L 2，4睤，0.5 mg/L NAA的 MS、B5、N6和 White的培養(yǎng)基上，每處理50個外植體，重復(fù)3次。觀察各培養(yǎng)基上外植體產(chǎn)生愈傷組織情況，30 d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率（愈傷誘導(dǎo)率（%）=愈傷組織數(shù)/接種后未污染的外植體┦×100）。

1.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。將0.5 cm左右的幼根切段分別接種到附加不同質(zhì)量濃度 6睟A、NAA、2，4睤的MS基本培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。每處理50個外植體，重復(fù)3次。觀察并記錄愈傷組織產(chǎn)生情況，30 d后，統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

1.2.4 叢生芽的誘導(dǎo)。選取生長狀態(tài)良好的愈傷組織顆粒，分散后接種到附加有不同質(zhì)量濃度的6睟A和NAA的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。每處理接種50個愈傷組織顆粒，重復(fù)3次。觀察叢生芽誘導(dǎo)情況，30 d后，統(tǒng)計分化率（分化率（%）=已分化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總┦×100）和分化不定芽的生長狀況。

1.2.5 生根的誘導(dǎo)。將生長旺盛的叢生芽分割成單芽后轉(zhuǎn)接到附加有不同質(zhì)量濃度的 6睟A 或 NAA的MS或1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。每處理接種50個不定芽，重復(fù)3次。觀察并統(tǒng)計生根情況（生根率（%）＝有生根現(xiàn)象數(shù)/原接種數(shù)×100）和生根系數(shù)（生根系數(shù)＝生根條數(shù)/有生根現(xiàn)象數(shù)）。

1.2.6 移栽馴化。將生根狀態(tài)基本一致的試管苗，經(jīng)過3 d開瓶煉苗后，洗凈培養(yǎng)基，分別移栽到河沙、蛭石、腐殖土、腐殖土+蛭石（7∶3）和腐殖土+河沙（7∶3）5 種栽培基質(zhì)中，并保持基質(zhì)相對濕度 85%左右。每種基質(zhì)移栽10株試管苗，3次重復(fù)。經(jīng)過30 d栽培馴化后，觀察并統(tǒng)計試管苗的生長狀況及成活率（成活率（%）=成活數(shù)/煉苗株數(shù)×100），篩選出最佳移栽基質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基和外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由表1可知，幼根愈傷組織誘導(dǎo)率以MS培養(yǎng)基為最高，達(dá)93.5%，White培養(yǎng)基最低，僅53.6%。幼葉愈傷組織誘導(dǎo)率以B5培養(yǎng)基為最高，達(dá)83.1%，MS培養(yǎng)基次之（80.9%），N6培養(yǎng)基較差（41.6%），White的誘導(dǎo)率最低（29.4%）。嫩芽愈傷組織誘導(dǎo)率以MS培養(yǎng)基為最高，達(dá)84.8 %，其次B5培養(yǎng)基為79.8%，在White培養(yǎng)基上最低（39.7%）；從愈傷組織的生長狀況來看，MS培養(yǎng)基上生長最好，愈傷組織呈淺黃綠色，質(zhì)地較疏松，White培養(yǎng)基上愈傷組織生長最緩慢，色暗且較硬；比較不同外植體的愈傷誘導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，幼根的愈傷誘導(dǎo)率最高，其次為嫩芽，幼葉的誘導(dǎo)率則較低。由此得出，MS作為誘導(dǎo)獨一味愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基，幼根為最佳外植體。

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表1 培養(yǎng)基和外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基 幼根誘導(dǎo)率

% 幼葉誘導(dǎo)率% 嫩芽誘導(dǎo)率% 愈傷組織ど長狀態(tài)

MS 93.5±0.2 80.9±0.5 84.8±1.2 ****

B5 81.7±1.1 83.1±0.9 79.8±1.2 ***

N6 73.8±0.3 41.6±1.4 72.7±2.3 **

White 53.6±2.4 29.4±0.7 39.7±0.7 *

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以獨一味無菌苗的幼根為外植體，分析不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對誘導(dǎo)愈傷組織的影響。由表2可知，在MS＋1.0 mg/L 2，4睤+0.5 mg/L 6睟A＋0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)條件下，外植體的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá) 93.5%，且出愈時間最短（7 d），愈傷組織呈淡黃且較疏松，生長速度快。因此，愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS＋1.0 mg/L 2，4睤+0.5 mg/L 6睟A＋0.5 mg/L NAA，pH 5.8。

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表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

培養(yǎng)基 植物激素∥mg/L2，4睤 6睟A NAA 誘導(dǎo)率% 出愈時ぜ洹蝑 愈傷組織ど長狀況

1 0.5 0.25 0.5 61.2±0.6 9 **

2 1.0 0.5 0.5 93.5±0.2 7 ****

3 1.5 1.0 0.5 76.2±0.7 9 **

4 0.5 0.5 1.0 89.2±0.4 10 ***

5 1.0 1.0 1.0 85.8±0.5 8 ***

6 1.5 0.25 1.0 81.4±1.5 8 ***

7 0.5 1.0 0.25 63.6±2.3 11 *

8 1.0 0.25 0.25 67.3±0.8 13 **

9 1.5 0.5 0.25 68.8±1.1 12 **

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽誘導(dǎo)的影響 將在 MS+1.0 mg/L 2，4睤+0.5 mg/L 6睟A+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基上生長狀況良好的幼根愈傷組織進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。由表3可知，5號培養(yǎng)基上，第19 天愈傷組織基部邊緣出現(xiàn)綠色小芽點，培養(yǎng)30 d后，有大量較粗狀、長勢好的不定芽出現(xiàn)，誘導(dǎo)率達(dá)88.8%。2、7 號培養(yǎng)基上，第23天有少量愈傷組織產(chǎn)生不定芽，且生長速度較快。1、4、8 號培養(yǎng)基上的愈傷組織于第 27天才開始出現(xiàn)不定芽，且芽較細(xì)弱，生長緩慢。3、6、9 號培養(yǎng)基上的愈傷組織分別在第24、25、26天分化出叢生芽，但基部愈傷組織有褐化現(xiàn)象。通過比較不同培養(yǎng)基上的叢生芽誘導(dǎo)結(jié)果得出，叢生芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為 MS＋1.0 mg/L 6睟A＋0.5 mg/L NAA。

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表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基 植物激素∥mg/L6睟A NAA

分化率% 出芽時ぜ洹蝑 愈傷組織ど長狀況

1 0.5 0.0 44.2±1.4 27 增長分化較慢

2 1.0 0.0 79.7±0.7 23 增長分化較快

3 1.5 0.0 63.5±1.5 25 后期易褐化死亡

4 0.5 0.5 49.4±1.0 27 增長分化較慢

5 1.0 0.5 88.8±0.4 19 增長分化最快

6 1.5 0.5 80.1±0.7 24 后期易褐化死亡

7 0.5 1.0 72.4±2.1 23 增長分化較快

8 1.0 1.0 63.3±1.4 27 增長分化較慢

9 1.5 1.0 56.4±0.8 26 后期易褐化死亡

2.4 組培苗生根的誘導(dǎo) 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加0.5 ﹎g/L NAA時，培養(yǎng)7 d就出現(xiàn)白根，30 d后組培苗的生根率和生根系數(shù)均達(dá)最高，分別為97.9%和7.5，根粗長且主根較發(fā)達(dá)；隨著NAA和6睟A濃度的增加，出根時間逐漸延長，生根系數(shù)與生根率均逐漸減小，說明高濃度的NAA和6睟A對獨一味生根有抑制作用；以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.5 ﹎g/L NAA 或6睟A時，生根誘導(dǎo)率和生根系數(shù)無明顯差異，但均低于1/2MS并附加同濃度NAA和6睟A體系的誘導(dǎo)率，且出根時間相對較長。由此可見，獨一味生根誘導(dǎo)以1/2MS基本培養(yǎng)基為宜，且低濃度的NAA和6睟A促進(jìn)生根。生根培養(yǎng)基的最適配方為：1/2MS＋0.5 mg/L NAA（表4）。

2.5 移栽馴化 由表5可知，以腐殖土+蛭石（7∶3）為移栽基質(zhì)時，平均成活率高達(dá)90%，其次是腐殖土+河沙（7∶3），平均成活率為80%，這2種基質(zhì)上長大的苗枝干較粗壯。因此，建議優(yōu)選腐殖土+蛭石（7∶3）作為獨一味試管苗移栽馴化的最佳培養(yǎng)基質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中，愈傷組織的形成，乃是停止分裂活動的組織細(xì)胞產(chǎn)生一種“返老還童”的現(xiàn)象，并再次呈現(xiàn)分裂功能的過程［8］。誘導(dǎo)愈傷組織是植物組織培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵，影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素很多，譬如培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、外植體類型等。不同外植體在不同培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)狀況通常不同。以獨一味的幼根、幼葉和嫩芽為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時，不同外植體在不同基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率存在明顯差異，其中幼根和嫩芽在MS基本培養(yǎng)上愈傷組織誘導(dǎo)率最高，幼葉在B5上誘導(dǎo)率最高。

表4 培養(yǎng)基和生長素對生根的影響

培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 生長素∥mg/L

6睟A NAA

生根率% 生根系數(shù) 生根時間d 生根情況

1 1/2MS 0.5 0 67.3±2.1 6.2 9 根多且粗長，主根發(fā)達(dá)

2 1/2MS 1.0 0 64.2±0.4 4.9 12 根多且細(xì)長，主根不發(fā)達(dá)

3 1/2MS 1.5 0 59.9±1.5 4.3 15 根少且細(xì)長，主根不發(fā)達(dá)

4 1/2MS 0 0.5 97.9±0.4 7.5 7 根多且粗長，主根發(fā)達(dá)

5 1/2MS 0 1.0 78.6±1.2 5.7 8 根多且細(xì)長，主根不發(fā)達(dá)

6 1/2MS 0 1.5 61.3±0.6 4.5 13 根少且細(xì)長，主根不發(fā)達(dá)

7 MS 0.5 0 60.6±1.0 5.1 11 根少且細(xì)短，主根不發(fā)達(dá)

8 MS 0 0.5 59.5±1.7 5.2 10 根少且細(xì)短，主根不發(fā)達(dá)

表5 不同基質(zhì)對獨一味試管苗移栽成活率的影響

試驗號 移栽基質(zhì) 移栽株數(shù) 平均成活ぶ曄 成活率%

1 蛭石 10 6 60±2.5

2 河沙 10 5 50±1.7

3 腐殖土 10 7 70±1.4

4 腐殖土+蛭石(7∶3) 10 9 90±0.6

5 腐殖土+河沙(7∶3) 10 8 80±1.2

除了基本營養(yǎng)物質(zhì)以外，為了促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)率，通常有必要在培養(yǎng)基中加入一種或一種以上的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，尤其是生長素和細(xì)胞分裂素［9］。在誘導(dǎo)愈傷組織時，宜采用較高質(zhì)量濃度的生長素，若生長素濃度過低，則表現(xiàn)為組織塊不能生長，時間過長，植物組織會死亡；但在分化階段，宜采用較低濃度的生長素，若生長素濃度過高，則表現(xiàn)為愈傷組織生長旺盛，細(xì)胞團(tuán)過于松散，不利于分化出苗［10］。一般情況下，細(xì)胞分裂素水平略高于生長素水平，但是過高水平的細(xì)胞分裂素傾向于誘導(dǎo)不定芽的形成，同時，促使側(cè)芽增生加速，結(jié)果形成過于細(xì)密的不定芽，使嫩芽質(zhì)量下降，不利于下一步的生根和種植［11-12］。本研究結(jié)果也證明了這一點，當(dāng)細(xì)胞分裂素 6睟A 與生長素2，4睤、NAA 的質(zhì)量濃度分別為 0.5、1.0、0.5 mg/L時，誘導(dǎo)出的愈傷組織生長量多且呈淺黃綠色，當(dāng)三者的濃度分別為1.0、0.5、0.25 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率顯著較低，且愈傷組織較硬，生長緩慢。在分化階段，當(dāng)6睟A和NAA的濃度分別為1.0、0.5 mg/L 時，不定芽的誘導(dǎo)率高，但在NAA濃度保持0.5 mg/L條件下，6睟A濃度增至1.5 mg/L時，愈傷組織后期出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，最后死亡，若6睟A濃度降至0.5 mg/L時，愈傷組織增長分化緩慢。

有學(xué)者認(rèn)為，在植物組培快繁中，根的形成要經(jīng)過根原基的誘導(dǎo)和根分化兩個階段，在第1階段激素誘導(dǎo)是不可或缺的，另外，可適當(dāng)使用低糖、低鹽以刺激根原基的形成，提高生根率；第2階段對激素是不敏感的，甚至持續(xù)在有激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)會影響根的分化及伸長，此階段需要提供植物生長必須的營養(yǎng)成份如糖、無機(jī)鹽等［13-14］。本研究結(jié)果表明，在附加有同濃度的6睟A或NAA條件下，高鹽濃度的MS培養(yǎng)基明顯抑制了獨一味組培苗的離體生根，當(dāng)使用1/2MS培養(yǎng)基時生根效果較好，且生出的根較粗長，主根發(fā)達(dá)，與自然根形態(tài)較接近，這不僅有利于水分及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還有利于植株營固著生活。另有研究報道，6睟A、NAA對植物組織培養(yǎng)瓶苗生根均有一定的促進(jìn)作用［15］。試驗結(jié)果表明，在1/2MS 基本培養(yǎng)基上，低濃度的6睟A或NAA均有利于根的生成，而高濃度的6睟A或NAA均表現(xiàn)出一定的抑制作用，這可能是前期培養(yǎng)階段所用激素水平影響了培養(yǎng)物的內(nèi)源性激素差異，從而表現(xiàn)出對生根的抑制作用。

在獨一味組培苗的移栽馴化過程中，選用適宜的培養(yǎng)基質(zhì)是很關(guān)鍵的。當(dāng)用單一的蛭石、河沙和腐殖土為培養(yǎng)基質(zhì)時，腐殖土上移栽的組培苗的移栽成活率最高，其次是蛭石。這是因為腐殖土具有良好的水肥供應(yīng)能力，能為獨一味幼苗生長提供一個穩(wěn)定持久的土壤環(huán)境；相對于河沙而言，蛭石是一種更為疏松的栽培基質(zhì)，良好的透氣性使其有利于幼苗弱小根系的生長、伸展。當(dāng)腐殖土與蛭石按一定比例混合使用時，因兼具有保肥、保水、透氣性好等特點，而更有利于幼苗的生長和發(fā)育，故幼苗成活率明顯高于單一基質(zhì)。

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