岳備 黃玉蘭 林曉婷 耿士莊 趙國峰 梁曉慶 劉延明

（黑龍江八一農墾大學生命科技學院，黑龍江大慶 163319）お

摘要

［目的］研究黃瓜原生質體分離的最佳酶解條件。［方法］以黃瓜子葉和懸浮細胞為材料，研究不同酶解條件對其原生質體的分離效果的影響。［結果］黃瓜子葉獲得高質量的原生質體的最佳條件為：酶液組合2%纖維素酶+1.0%果膠酶，酶解時間8 h，酶液濃度0.7 mol/L，酶液pH 5.5。［結論］該試驗研究了不同酶解條件對黃瓜原生質體的分離效果的影響，為黃瓜的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

關鍵詞黃瓜(獵ucumis sativus 獿. )；原生質體；酶解條件；離心

中圖分類號 SB642.2文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06145-03

お

The Effect of Decomposing Conditions on Protoplast Isolation of Cumber

YUE Bei, HUANG Yu瞝an et al

(Faculty of Biological Life, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319)

Abstract ［Objective］ To study the optimal enzymolysis conditions on protoplast isolation ofcumber. ［Method］ Using cotyledons and suspension of cumber as test materials, effects of various enzymolysis conditions on protoplast isolation were studied. ［Result］ The optimum conditions for high yield of viable protoplast were as follows: enzyme combination containing 2% cellulase + 1.0% pectinase, mannitol concentration at 0.7 mol/L, enzymolysis time of 8 h and pH=5.5. ［Conclusion］ Effects of different enzymolysis conditions on protoplast isolation of cumber were studied, which will provide basis for further development and utilization.

Key words 獵ucumis sativus 獿.; Protoplast; Enzymolysis conditions; Centrifugation

お

基金項目 黑龍江省青年科學基金(QC2012C103)；校級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2013100223003）。

作者簡介

岳備(1991-)，男，河北邢臺人，本科，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，碩士，從事植物細胞工程研究。

收稿日期 20140529

黃瓜(獵ucumis sativus 獿.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)黃瓜屬(獵ucumis)一年蔓生草本植物，是我國主要的蔬菜作物之一，其播種面積和總產量在我國主要蔬菜中位居前列［1］。“優(yōu)質、高產、多抗、生態(tài)、高效”黃瓜新品種的選育迫在眉睫。傳統(tǒng)的轉基因抗病育種，可能會產生諸如啟動子、標記基因等外來因素，帶來潛在的危險性，并且遠緣雜交的不親和性阻礙了這些技術在黃瓜育種中的應用。以原生質體融合為基礎的體細胞雜交技術可以克服遠緣雜交的前述困難，實現(xiàn)不同物種部分基因組或特異染色體的轉移，在轉基因育種應用中還可以把外源目的基因導入原生質體，創(chuàng)造出新的種質┳試椽［2］。

分離高質量原生質體是進行原生質體培養(yǎng)和體細胞雜交的前提，黃瓜屬間原生質體融合研究還很少，且沒有得到再生植株［3-4］。主要是原生質體的產量和活力限制了該方法在黃瓜育種上的應用。原生質體產量和活力在很大程度上取決于材料來源、水解酶組成、酶解時間等酶解條件。目前，國內對植物黃瓜原生質體的制備、純化及融合的研究相對較少，試驗以黃瓜子葉和懸浮細胞為材料，研究不同酶液組合、酶解時間、酶液滲透壓及酶液pH值等不同條件對其原生質體的分離效果，以期為制備高質量的黃瓜原生質體提供理想條件與參數(shù)，并為進一步利用植物細胞融合技術改良和生產黃瓜提供理論基礎。

1材料與方法

1.1 材料

元豐園黃瓜種子；甘露醇，購自天津市福晨化學試劑廠；纖維素酶(Onozuka R-10)和果膠酶(Macerozyme R-10)，購自日本。

1.2 方法

1.2.1

無菌苗和胚性愈傷組織的制備。精選飽滿的黃瓜元豐園種子，水浸種10~20 min后，用70%乙醇處理20~30 s，然后用0.1% HgCl2消毒8~10 min，再用無菌水洗滌4~5次，胚根端插入MS附加0.3%蔗糖和0.7%瓊脂的固體培養(yǎng)基中，置于(25±2)℃，1 000 lx光照13~15 h/d下培養(yǎng)，制備無菌苗。

將5~7 d無菌苗子葉葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用長柄鑷子將切好的外植體接種到誘導培養(yǎng)基中，進行愈傷組織誘導獲得初代愈傷組織。初代愈傷組織在3種激素6睟A、IAA、AgNO3的調控下，繼代培養(yǎng)成胚性愈傷組織。將胚性愈傷組織接種液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，獲得黃瓜懸浮細胞。

1.2.2

黃瓜子葉和懸浮細胞的原生質體制備［5-7］。選取植株頂端未充分展開的幼嫩子葉，清水沖洗干凈，75%酒精浸泡數(shù)秒，再用0.1%升汞溶液消毒7 min，然后用無菌水清洗4~5次，撕下葉片下表皮，并將去掉下表皮一面置于盛有酶液培養(yǎng)皿中，在黑暗條件下25 ℃恒溫搖床上50 r/min振蕩，以分離原生質體。

取繼代5~10 d質地疏松的黃瓜懸浮細胞1~2 g，置于盛有10 ml酶液的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋Parafilm膜封口。25 ℃、50 r/min的搖床上黑暗振蕩酶解，以分離原生質體。

1.2.3

不同酶解條件對其原生質體的分離效果。①酶種類與濃度。酶液由纖維素酶和果膠酶組成以0.9 mol/L甘露醇作為滲透壓調節(jié)劑。采用隨機組合試驗設計，其中纖維索酶濃度設3個水平：2％，1.5 ％，1.0％。果膠酶濃度設3個水平：2.0％，1.5％，1.0％。②酶解時間。酶解時間設為2、4、6、8和10 h共5個水平。③甘露醇濃度。甘露醇濃度(﹎oI/L)設5個水平0.5，0.6，0.7，0.8，0.9。④酶液pH值。酶液的pH值設5個水平：4.5，5.0，5.5，6.0，6.5。

1.2.4

黃瓜原生質體純化與檢測。酶解后，懸浮液用300目濾網(wǎng)過濾，600 r/min離心5 min，收集原生質體。收集到的原生質體采用界面法［8-9］進一步純化。所有試驗重復3次，取平均值。原生質體產量用血球計數(shù)板計數(shù)，以每g鮮重子葉和懸浮細胞分離得到的原生質體個數(shù) (個/g)來表示，用0.01%酚藏紅花染色測定原生質體活性，相關計算式如下：原生質體密度(個/ml)=每個小格內的原生質體平均數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)；原生質體產量（個 /g）= 懸浮液中的原生質體數(shù)（個/ml）×總體積（ml）/ 質量（g）；原生質體的完整率(%)=完整原生質體個數(shù)(玿)/原生質體總數(shù)(X)；完整產率(個/g)=原生質體的產率(個/g)×原生質體的完整率(%)；存活率(%) = (未染色原生質體數(shù)/原生質體總數(shù))×100%；有活力原生質體產量（個/g）=原生質體產量×存活率。

2 結果與分析

2.1 黃瓜胚性愈傷組織誘導及懸浮細胞培養(yǎng)

由子葉誘導的愈傷組織呈黃綠色，組織生長良好。在優(yōu)化的培養(yǎng)基上進行黃瓜細胞的懸浮培養(yǎng)，懸浮細胞可不斷增值，狀態(tài)良好(圖1)。

圖1黃瓜原生質體（A:子葉；B:懸浮細胞）

2.2 酶濃度對不同材料黃瓜原生質分離的影響

將繼代7 d生長活性較高的懸浮細胞和7~9 d黃瓜無菌苗子葉，分別置于表1所示2種不同組合酶液中。由表l可知，纖維素酶濃度一定時，隨果膠酶濃度的增加，原生質體產量先增后減，當果膠酶濃度為1.0％時產量最高。當果膠酶濃度一定時，原生質體產量隨著纖維索酶濃度先增后減。綜合考慮，原生質體產率適中、原生質體活力產量較高、完整率較高的酶液組合為纖維素酶2%+果膠酶1.0%。

在原生質體密度和活力原生質體產量方面，子葉和懸浮細胞二者作為起始材料出現(xiàn)較大差別。在最佳酶濃度組合下，子葉和懸浮細胞活力原生質體的產率分別為7.5×106個/g和6.9×106個/g，完整率沒有太大的差別。從整體上來看，子葉以其較高的活性和較高的完整率成為最佳可選┎牧稀＊

表1 酶液組成對原生質體分離的影響

酶液濃度∥%

纖維素酶果膠酶

子葉

原生質體總量106個/gFW 活力原生質體產量106個/gFW 完整率106個/gFW

懸浮細胞

原生質體總量106個/gFW 活力原生質體產量106個/gFW 完整產率106個/gFW

3 1.5 6.5±0.2 6.1±0.4 5.7±0.1 7.6±0.1 6.0±0.1 5.6±0.1

3 1.0 6.7±0.1 6.3±0.1 5.8±0.4 7.8±0.4 6.1±0.4 5.8±0.4

3 0.8 6.3±0.4 5.8±0.2 5.4±0.5 7.5±0.2 5.8±0.3 5.5±0.2

2 1.5 6.9±0.2 6.4±0.7 6.0±0.4 7.9±0.4 6.3±0.2 6.1±0.3

2 1.0 7.8±0.4 7.5±0.1 6.9±0.2 8.9±0.3 6.9±0.4 6.8±0.4

2 0.8 7.5±0.2 7.0±0.2 6.7±0.1 8.8±0.6 6.7±0. 6.8±0.2

1 1.5 6.2±0.1 5.6±0.3 5.3±0.5 6.7±0.1 5.4±0.4 5.4±0.4

1 1.0 6.5±0.4 6.0±0.5 5.3±0.8 6.9±0.3 5.9±0.2 5.5±0.5

1 0.8 5.9±0.5 6.1±0.2 5.2±0.4 6.4±0.4 5.3±0.3 5.3±0.3

2.3 酶解時間對黃瓜原生質體分離的影響

在2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶酶液中，研究了不同的酶解時間對子葉原生質體游離產率和完整率的影響。結果（表2)表明，在酶解4 h后便有少量原生質體生成，隨著時間的延長，原生質體的數(shù)量也逐漸增加；酶解8 h便產生大量原生質體，其活力和完整率為最佳，隨著酶解時間的延長，會出現(xiàn)活力和完整率下降的趨勢。

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表2 酶解時間對原生質體分離的影響

組別 酶解な奔洹蝖 原生質體總量106個/gFW 活力原生質體產量106個/gFW 完整率106個/gFW

1 2 0.6±0.2 0.3±0.1 0.1±0.1

2 4 3.1±0.3 2.5±0.2 1.8±0.2

3 6 4.8±0.4 4.1±0.2 3.1±0.2

4 8 7.1±0.2 7.0±0.4 5.9±0.5

5 10 6.9±0.2 6.7±0.3 4.6±0.3

2.4 甘露醇濃度對原生質體分離效果的影響

在2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶酶液中添加不同濃度的甘露醇，酶解8 h，比較原生質體的分離情況，結果見表3。隨著甘露醇濃度的增加，原生質體產量和有活力原生質體產量都隨之增加，當濃度達0.7 mol/L時，有活力原生質體的產量最高，為7.0×106個/g，完整率為5.9×106個/g，獲得的原生質體形狀、大小基本一致，邊緣清晰，內含物多，完整率較高。隨著甘露醇濃度的升高，原生質體的產量和有活力原生質體的產量開始下降。

表3 不同甘露醇濃度對原生質體分離的影響

組別 甘露醇づǘ取蝝ol/L 原生質體總量106個/gFW 活力原生質體產量106個/gFW 完整率106個/gFW

1 0.5 5.6±0.3 5.0±0.6 4.1±0.3

2 0.6 6.4±0.2 5.9±0.5 4.7±0.2

3 0.7 7.8±0.2 7.0±0.2 5.9±0.4

4 0.8 6.9±0.5 6.7±0.3 4.6±0.2

5 0.9 6.8±0.4 5.9±0.1 4.3±0.3

2.5 酶液pH值對黃瓜原生質體分離的影響

在2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶酶液中添加0.7 mol/L甘露醇，酶解8 h，比較原生質體在不同pH值時的分離情況，結果見表4。當pH為4.5時，有活力的原生質體產量較低，細胞完整率較低，隨著pH值的逐漸升高，產量逐步增加，原生質體狀態(tài)較好；當pH為5.5時，活力原生質體產量高（7.0×106個/g），有活力原生質體產率和完整率都較高；隨著pH值的升高，有活力原生質體的產量開始下降，完整率降低。

表4 不同酶液pH對原生質體分離的影響

組別 pH值mol/L 原生質體總量106個/gFW 活力原生質體產量106個/gFW 完整率106個/gFW

1 4.5 3.1±0.2 2.7±0.1 2.4±0.2

2 5.0 4.5±0.3 3.9±0.3 3.2±0.3

3 5.5 7.8±0.5 7.0±0.4 6.2±0.1

4 6.0 6.9±0.4 6.1±0.5 4.7±0.4

5 6.5 5.1±0.3 4.2±0.3 3.1±0.3

3結論與討論

起始材料是影響植物原生質體分離培養(yǎng)的重要因素［10-11］。試驗以黃瓜無菌苗子葉和懸浮細胞為材料，對分離制備的原生質體的效果進行比較，得出子葉制備的原生質體優(yōu)于懸浮細胞，并且原生質體的活性較高，平均為7.5×106個/g；懸浮細胞的產率也較高，但其活力比子葉低，平均為6.9×106個/g，完整率沒有太大的差別。雖然懸浮細胞原生質體總量高于子葉分離的原生質體，但其原生質體活力產量卻低于子葉，可能是由于懸浮細胞傳代次數(shù)多，造成活性有所降低。

游離原生質體時，適宜的酶解條件因植物的種類不同有很大差異［12-14］。試驗中酶液組成以2%纖維素酶+1%果膠酶為最佳。原生質體游離時酶解是關鍵，而酶解中酶的種類和濃度更為重要。以往試驗多采用3種以上酶，而且酶解時間很長，一般在10 h以上［15-17］。試驗中酶液組成以R-10纖維素酶2%+R-10果膠酶1%較合適，只采用2種酶，僅8 h就可得到大量高活力的原生質體。一般認為原生質體的分離，纖維素酶和果膠酶是必要的［18］，主要是纖維素酶和果膠酶更易接觸細胞壁和原生質體間的果膠，從而使原生質體更易達到分離［19］。試驗中隨著酶解時間的延長，原生質體的數(shù)量也逐漸增加；酶解8 h便產生大量原生質體，其活力和完整率為最佳，隨著酶解時間的繼續(xù)延長，會出現(xiàn)活力和完整率下降的趨勢?？赡苁怯捎谑ゼ毎诤?，原生質體受到酶液的傷害［10］。研究中采用甘露醇作為滲透壓調節(jié)劑，當甘露醇濃度較低時細胞膜容易破裂，造成原生質體的數(shù)量偏低；當甘露醇濃度較高時，原生質體則易失水而收縮影響正常的代謝活動，其生理活性就會降低［20］。甘露醇濃度為0.7 mol/L時得到的原生質體產量、活力及完整率最佳。酶液的pH對原生質體的產率和活力都有很大的影響，試驗中酶液最適pH為5.5，太低或過高時，產量都不高。其原因是2種酶的活力受pH影響，纖維素酶的最適pH是5.5~6.0，果膠酶有效作用的pH是2.56。可能由于二者的互作效應，試驗中酶液的最佳pH值為5.5。

試驗結果表明，黃瓜子葉獲得高質量的原生質體的最佳條件為：酶液組合2%纖維素酶+1.0%果膠酶，酶解時間8 h，酶液濃度0.7 mol/L，酶液pH 5.5。

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