遇文婧 劉志華 王志英 古麗吉米拉米吉提 黃穎 刁桂萍

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省森林保護研究所，黑龍江哈爾濱 150040）お

摘要 ［目的］構(gòu)建刺激植物響應(yīng)蛋白獷pl1基因的真核表達載體，篩選多拷貝酵母轉(zhuǎn)化子。［方法］以深綠木霉（玊richoderma atroviride）ACCC30153的cDNA為模板進行PCR獲得獷pl1基因片段，并將目的片段插入表達載體pPIC9K的相應(yīng)位置，獲得重組表達載體，并將pPIC9K勃獷pl1轉(zhuǎn)入畢赤酵母（玃ichia pastoris）GS115中，并用不同中終濃度的遺傳霉素G418篩選多拷貝重組酵母菌株。［結(jié)果］對重組載體進行PCR及雙酶切檢測為陽性；在含有終濃度為2 mg/ml遺傳霉素G418的YPD平板上篩選得到7株多拷貝的轉(zhuǎn)化子GS115睧pl1，經(jīng)PCR鑒定1株轉(zhuǎn)化子呈陽性。［結(jié)論］ 獷pl1基因的載體構(gòu)建及多拷貝酵母轉(zhuǎn)化子篩選為以后大量分離純化Epl1蛋白并研究其功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 深綠木霉ACCC30153；刺激植物響應(yīng)蛋白；畢赤酵母

中圖分類號 SB763.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06163-03

お

Vector Construction of the Eliciting Plant Response Protein Gene 獷pl1 and Yeast Transformation

YU Wen瞛ing, DIAO Gui瞤ing et al

(Heilongjiang Forestry Protection Institute, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract ［Objective］ To construct eukaryon expression vector of the eliciting plant response protein gene 獷pl1 and screen multicopy yeast transformant. ［Method］ Based on the cDNA from biocontrol agent 玊. atroviride strain ACCC30153, the 獷pl1 gene segment was obtained by PCR and constructed into vector pPIC9K to obtain the recombinant vector pPIC9K勃獷pl1. The recombinant vector was transformed into 玃. pastoris strain GS115, and the multicopy yeast transformants was screened by Geneticin 418 with different final concentration. ［Result］ PCR and double digest detection identified that pPIC9K勃獷pl1 was obtained; the seven multicopy yeast transformants were obtained on the YPD medium containing with final concentration of 2 mg/ml, and one strain was positive by PCR detection. ［Conclusion］ The vector construction of Epl1 gene and screening of high expressing yeast transformant provide the high瞖fficiency expression strain for separating and purifying 獷pl1 and establish a basis for the further functional research of eliciting plant response protein Epl1.

Key words 玊richoderma atroviride ACCC30153; Eliciting plant response protein; 玃. pastoris

お

基金項目 哈爾濱市科技局青年科技創(chuàng)新人才項目（2013RFQXJ02）資助；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（2572014 BA08）。

作者簡介 遇文婧（1984- ），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向：森林保護。*通訊作者，副教授，從事森林保護研究。

收稿日期 20140605

刺激植物響應(yīng)蛋白Epl1（Eliciting plant response protein 1）是一種小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，屬于cerato瞤latanin家族。對來源于綠色木霉（玊.virens）刺激植物響應(yīng)蛋白SM1［1］和深綠木霉（玊.atroviride）的刺激植物響應(yīng)蛋白Epl1研究表明，2個蛋白均對植物無任何毒性，還具有促進植物生長提高植物對病害的免疫作用［2］。王允等［3］將棘孢木霉（玊.asperellum）T4菌株的獷plt4（Epl1）基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母（P.pastoris）中，用重組蛋白Eplt4處理大豆葉片，接種大豆灰斑?。–ercosporidium sofinum ）12 h后，感病區(qū)域（0.75%）明顯低于未用EplT4處理的大豆葉片（5.17%）。Djonoviヽ＇等研究表明，深綠木霉（玊.atroviride）ATCC 74058 菌株的Epl1蛋白能在不同碳源誘導下檢測到，而且在立枯絲核菌（玆hizoclonia solani）細胞壁誘導和立枯絲核菌對峙培養(yǎng)條件下均高表達［4］。Freitas等對來源于綠色木霉刺激植物響應(yīng)蛋白SM1研究發(fā)現(xiàn)，用缺失SM1基因的木霉處理感染炭疽病的玉米葉片，葉片病斑明顯多于野生型木霉處理過的感病葉片，證明SM1基因能夠誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR）［5］。上述研究都證實了刺激植物響應(yīng)蛋白是木霉誘導抗性機制所需要的。筆者從深綠木霉ACCC30153菌株中分離出一個刺激植物響應(yīng)蛋白獷pl1基因，將其ORF 的cDNA構(gòu)建到高效畢赤酵母真核表達載體上，并用電轉(zhuǎn)化方法將獷pl1基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，通過遺傳霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因畢赤酵母菌株，以期為后續(xù)大量分離純化Epl1蛋白并研究其功能奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體。深綠木霉（玊.atroviride）ACCC30153菌株，由中國農(nóng)業(yè)微生物保藏管理中心提供；畢赤酵母（玃.pastoris）GS115菌株、真核表達載體菌株TOP10F′瞤PIC9K和大腸桿菌TOP10 菌株，均由哈爾濱工業(yè)大學生物實驗室提供。

1.1.2 主要試劑。內(nèi)切酶獷coR I，玁ot I，玈ac I及T4 DNA連接酶，購自Promega公司；玊aq plus DNA Polymerase，購自上海生工公司；DNA Marker DL2000，購自北京泛基諾生物技術(shù)公司；酵母基因組DNA提取試劑盒，購自天為時代公司；Geneticinq（G418），購自Invitrogen公司；（NH4）2SO4，購自Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 深綠木霉獷pl1基因高效畢赤酵母真核表達載體構(gòu)建。在深綠木霉Epl1的ORF序列兩端引入獷coR I和玁ot I酶切位點，進行PCR擴增并回收目的片段。采用獷coR I和玁ot I雙酶切，將目的片段連入pPIC9K 載體，獲得pPIC9K勃獷pl1重組質(zhì)粒，并對重組質(zhì)粒進行PCR和雙酶切檢測。根據(jù)獷pl1基因序列和酵母表達載體的多克隆位點設(shè)計并合成的引物序列如下：

上游引物Ep1y：5睞TCGGAATTCGATACGGTCTCCT睞CGACAC3（劃線部分為獷coR I酶切位點）；

下游引物Ep2y：5睠GATGCGGCCGCGAGGCCGCAGTTGCTCACGGC3（劃線為玁ot I酶切位點）。

1.2.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)化子的篩選。采用電轉(zhuǎn)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母細胞中，涂于RDB（186 g/L 1 mol/LB山梨醇，10 g/L瓊脂粉，100 ml/L 10×Dextrose，100 ﹎l/L 10×酵母氮源堿，2 ml/L 500×Biotin，10 ml/L 100×50 含L補勸彼?，L 蛋氨酸，L怖蛋彼?，L擦漣彼岷蚅慘熗漣彼岬陌被酸）平板，30 ℃培養(yǎng)。挑取單菌落搖菌，然后分別取10 μl菌液點在含遺傳霉素0、0.5、0.75、1.0、1.75和2.0 mg/ml YPD平板上培養(yǎng)，挑取含高濃度遺傳霉素G418的YPD平板上的轉(zhuǎn)化子，于BMGY培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)，提取酵母基因組DNA，并進行PCR檢測［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺激植物響應(yīng)蛋白獷pl1基因真核表達載體的構(gòu)┙ 對所構(gòu)建的深綠木霉獷pl1基因真核表達載體進行了PCR和雙酶切驗證。用載體構(gòu)建引物可從轉(zhuǎn)化子中擴增出大小為400~500 bp左右的目的片段（圖1），初步驗證了目的基因已經(jīng)于載體pPIC9K鏈接成功。用獷coR I和玁ot I進行雙酶切同樣可獲得目的基因條帶（圖2），說明獷pl1基因已經(jīng)正確連入載體pPIC9K中。

注：M為DNA marker DL2000；1-4為PCR產(chǎn)物。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K睧pl1的PCR檢測

注：M為DNA marker DL2000；1~3為重組載體pPIC9K睧pl1雙酶切產(chǎn)物；4為空載體pPIC9K雙酶切產(chǎn)物。

圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K睧pl1雙酶切檢測

2.2 高效畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定 通過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，用不含組氨酸的RDB基本培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化子進行篩選，以未轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115作為對照（圖3）。

從RDB轉(zhuǎn)化平板上選取50個重組子分別接種到含有不同終濃度遺傳霉素G418的YPD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d。圖4表明，在不添加G418的YPD平板上所有轉(zhuǎn)化子均繼續(xù)生長；在含有終濃度為0、0.5、0.75和1.0 mg/ml G418 的YPD平板上少量轉(zhuǎn)化子不生長；在含有終濃度為1.75 mg/ml G418的YPD平板上少量轉(zhuǎn)化子生長；而在含有終濃度為2.0 mg/ml G418的YPD平板上僅有1株轉(zhuǎn)化子生長。

PCR檢測結(jié)果可從終濃度為2.0 mg/ml G418的YPD平板上的轉(zhuǎn)化子中擴增出大小約為869 bp的目的片段（包含452 bp載體長度），與重組載體pPIC9K勃獷pl1的目的條帶一致，呈陽性；而對照空載體轉(zhuǎn)化子的PCR條帶大小約為452 bp，與載體pPIC9K的PCR條帶一致（圖5）。以上結(jié)果表明，已成功獲得1株高效表達的畢赤酵母轉(zhuǎn)化菌株GS115睧pl1。

注：A為轉(zhuǎn)入重組 pPIC9K睧pl1載體的畢赤酵母；B為未轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115。

圖3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化

3 結(jié)論與討論

刺激植物響應(yīng)蛋白Epl1是來源于生物防治菌木霉（玊richoderma 玸pp.）的誘導植物系統(tǒng)防御響應(yīng)的小分子疏水蛋白，能夠刺激植物生長并提高其免疫能力。由于我們很難從木霉中直接分離大量天然的Epl1蛋白，因此Epl1重組蛋白的表達是研究的首選方向。

目前而言，一種是利用大腸桿菌原核表達載體進行重組表達。大腸桿菌表達的重組蛋白優(yōu)勢在于重組菌株構(gòu)建容易，重組蛋白產(chǎn)量高，發(fā)酵條件即經(jīng)濟又可控制，唯一的缺點是重組蛋白往往形成包涵體，無活性，必須經(jīng)過復性后才能后續(xù)應(yīng)用?，F(xiàn)已成功在大腸桿菌中表達的蛋白及酶類有：哈茨木霉（玊.harzianum）內(nèi)切幾丁質(zhì)酶Chit33和Chit42［7］，以及深綠木霉（玊.atroviride）P1的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶ech30均在大腸桿菌中成功表達［8］。另外棘孢木霉（玊.asperellum）T203促進植物生長的1舶被環(huán)丙烷-羧酸脫氨酶ACCD在大腸桿菌pAlter睧X1中表達出有活性的酶［9］，此外還包括李氏木霉（玊.reesei）Rut C30的beta瞲ylanase等多種具有活性的酶類及蛋白類［10］。另一種是利用巴斯德畢赤酵母（玃.pastoris）高效表達系統(tǒng)進行酵母表達。畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于可以在廉價的非選擇性培養(yǎng)基中生長，具有旺盛的生長力，對發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙醇具有耐受性，有較好的發(fā)酵基礎(chǔ)，非常有利于實現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)?，F(xiàn)已經(jīng)成功在畢赤酵母中表達的具有活性的酶及蛋白類有：綠色木霉（玊.virens）誘導子Sm1［11］及哈茨木霉（玊.harzianum）T34的角質(zhì)酶Thcut1等［12］。

有關(guān)刺激植物響應(yīng)蛋白的研究已有報道，但其分子作用

機制仍不十分清楚。試驗將深綠木霉刺激植物響應(yīng)蛋白

注：A為G418終濃度為0 mg/ml；B為G418終濃度為0.5 mg/ml；C為G418終濃度為0.75 mg/ml；D為G418終濃度為1.0 mg/ml；E為G418終濃度為1.75 mg/ml；F為G418終濃度為2.0 mg/ml。

圖4 多拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選

注：1為重組菌株GS115睧pl1基因組DNA的PCR產(chǎn)物；2為Marker DL2000；3為空載體轉(zhuǎn)化子GS115瞤PIC9K基因組DNA的PCR產(chǎn)物；4為載體pPIC9K的PCR產(chǎn)物；5為重組質(zhì)粒pPIC9K勃獷pl1的PCR產(chǎn)物對照。

圖5 重組菌株GS115睧pl1的 PCR檢測

獷pl1基

因克隆到分泌性表達載體pPIC9K上，可以使酵母轉(zhuǎn)化子合成的重組Epl1蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中，這種設(shè)計可大大簡化后期重組Epl1的提取工藝，便于得到高活性Epl1產(chǎn)品。將陽性重組質(zhì)粒pPIC9K勃獷pl1轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌株GS115中獲得多克隆拷貝的重組基因工程菌株GS115睧pl1，為獷pl1基因編碼蛋白的大量生產(chǎn)、純化、蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻

［1］ DJONOVI〤＇ S，VARGAS W A，KOLOMIETS M V，et al.A proteinaceous elicitor Sm1 from the beneficial fungus 玊richoderma virens is required for induced systemic resistance in maize ［J］.Plant Physiology，2007，145：875-889.

［2］ SEIDL V，MARCHETTI M，SCHANDL R，et al.Epl1，the major secreted

protein of 獺ypocrea atroviridis on glucose，is a member of a strongly conserved protein family comprising plant defense response elicitors ［J］.FEBS J，2006，273：4346-4359.

［3］ WANG Y，SONG J，WU Y，et al.Eplt4 proteinaceous elicitor produced in 玃ichia pastoris has a protective effect against 獵ercosporidium sofinum infections of soybean leaves ［J］.Appl Biochem Biotechnol，2013，169：722-737.

［4］ DJONOVI〤＇ S，POZO M J，DANGOTT L J，et al.Sm1，a Proteinaceous elicitor secreted by the biocontrol fungus 玊richoderma virens induces plant defense responses and systemic resistance ［J］.Mol Plant Microbe Interact，2006，19：838-853.

［5］ FREITAS R S，STEINDORFF A S，RAMADA M H，et al.Cloning and characterization of a protein elicitor Sm1 gene frome 玊richoderma harzianum ［J］.Biotechnol Lett，2014，36：783-788.

［6］ 胡砷.重組chi46在畢赤酵母中的表達及抗病原菌初步研究 ［C］.哈爾濱：東北林業(yè)大學，2007.

［7］ BOOR H，SIMOLIN H，COTTAZ S，et al.Heterologous expression and site瞕irected mutagenesis studies of tow 玊richoderma harzianum chitinases，Chit33 and Chit42，in 獷scherichia coli［J］.Protein Expression and Purification，2007，51：216-226.

［8］ KLEMASDAL S S，CLARKE J L，HOELL I A，et al.Molecular cloning，characterization，and expression studies of a novel chitinase gene （ech30）from the mycoparasite 玊richoderma atroviride strain P1 ［J］.FEMS Microbiol Lett，2006，256：282-289.

［9］ VITERBO A，LANDAU U，KIM S，et al.Characterization of ACC deaminase from the biocontrol and plant growth瞤romoting agent 玊richoderma asperellum T203 ［J］.FEMS Microbiol Lett，2010，305：42-48.

［10］ JUN H，BING Y，KEYING Z，et al.Expression of a 玊richoderma reesi betaxylanase gene in 獷scherichia coli and activity of the enzyme on fiber瞓ound substrates ［J］.Proteinv Expr Purify，2009，67：1-6.

［11］ BUENSANTEAI N，MUKHERJEE P K，HORWITZ B A，et al.Expression and purification of biologically active 玊richoderma virens proteinaceous elicitor SM1 in 玃ichia pastoris［J］.Protein Expr Purify，2010，72：131-138.

［12］ RUBIO M B，CARDOZA R E，HERMOSA R，et al.Cloning and characterization of the Thcut1 gene encoding a cutinase of 玊richoderma harzianum T34 ［J］.Curr Genet，2008，54：301-312.