蔣倩倩 李慧玲 劉莉莉 高寧 程玉鵬

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）お

摘要

［目的］研究重組敬釗毒素在畢赤酵母中的表達與純化。［方法］通過設(shè)計、構(gòu)建Jztx-III/pPIC9k表達載體，經(jīng)電轉(zhuǎn)化、甲醇誘導(dǎo)后使敬釗毒素在畢赤酵母GS115中進行表達，并利用C-端6×His標(biāo)簽進行分離純化。［結(jié)果］Jztx-III可以在畢赤酵母GS115中高效表達，經(jīng)親和層析純化后其產(chǎn)量可達到95 mg/L。［結(jié)論］該試驗結(jié)果解決了敬釗毒素資源有限產(chǎn)量較低的問題。

關(guān)鍵詞 蜘蛛毒素；畢赤酵母；基因工程

中圖分類號 SB188文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06166-01

お

The Expression and Purification of Jingzhao Toxin in 玃ichia pastoris

JIANG Qian瞦ian, CHENG Yu瞤eng et al

(College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract ［Objective］ To study expression and purification of Jingzhao toxin in 玃ichia pastoris. ［Method］ Jztx睮II GS115/pPIC9k plasmid was constructed to express Jingzhao toxin睮II in 玃ichia pastoris. A 6×His tag in C瞭erminus was employed to purify the recombinant Jztx 睮II. ［Result］ The results showed that Jztx 睮II can be expressed in 玃ichia pastoris 獹S115 effectively. The production of Jztx 睮II can reach to 95 mg/L after purified by affinity chromatography. ［Conclusion］ The experiment results solve the problem of lower yield of Jingzhao toxin limited resource.

Key wordsSpider toxin; 玃ichia pastoris; Genetic engineering

お

基金項目 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校基金（201004）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃（2012RCQ12）。

作者簡介

蔣倩倩（1981-），女，黑龍江哈爾濱人，講師，碩士，從事生物制藥研究。*通訊作者，副教授，博士，從事生物制藥┭芯?。?/p>

收稿日期 20140604

蜘蛛毒素成分復(fù)雜，由一系列蛋白質(zhì)、多肽、神經(jīng)毒素、核酸、氨基酸、無機鹽組成，這些成分可以對脊椎動物和無脊椎動物產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)［1］。根據(jù)蜘蛛毒素的藥理和生物化學(xué)特性，蜘蛛毒素可以分為離子通道毒素、非神經(jīng)毒素、酶及低分子量化合物［2］。

敬釗毒素-III (Jztx-III，分子量3 919.3 Da)是從中國狼蛛敬釗纓毛蛛中分離的小分子多肽，由36個氨基酸組成且分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其內(nèi)部含有3個交錯的二硫鍵分別是：I-IV, II-V和 III-VI (Cys4-Cys19, Cys11-Cys24, and Cys18-Cys31)［3］。這種毒素專一作用于鉀離子電壓門控通道Kv2.1和鈉離子電壓門控通道Nav1.5，而對其他亞型的電壓通道無作用。正是由于其對電壓離子通道的特異性及獨特的分子機制，使得Jztx-III成為研究電壓敏感型毒素和離子通道相互作用的理想工具。但是由于敬釗毒素來源有限且含量低，限制了其在研究和醫(yī)療上的應(yīng)用，因此研究開發(fā)蜘蛛毒素合成方法降低生產(chǎn)成本是目前亟待解決的問題?；蚬こ淌巧a(chǎn)生物活性肽的理想途徑，但目前對于重組Jztx-III多肽的表達的研究鮮有報道。筆者通過設(shè)計構(gòu)建pPIC9k/Jztx-III表達載體，在畢赤酵母中表達重組敬釗毒素-III并利用其C-端6×His標(biāo)簽進行分離純化，以期為蜘蛛毒素的藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

表達載體 pPIC9k、獷. coli 獼M109、畢赤酵母GS115菌株，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生物技術(shù)教研室保存。

1.2 Jztx-III的基因設(shè)計與合成

根據(jù)敬釗毒素-III全長基因序列及畢赤酵母偏愛密碼子對其進行全基因合成，5端添加EcoRⅠ位點，3端添加NotⅠ位點，同時在3端添加編碼6×His的分離純化標(biāo)簽，該基因合成由上海生工完成。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ雙酶切pPIC9k載體，以T4連接酶將合成的JZTX-III基因與載體連接，16 ℃連接12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109中。挑出單菌落，進行雙酶切鑒定，并送往上海生工進行測序。

1.4 pPIC9k/Jztx-III電轉(zhuǎn)化畢赤酵母

用SacⅠ酶切重組表達質(zhì)粒 pPIC9k/JZTX-III使之線性化，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌GS115，轉(zhuǎn)化菌液涂布 RDB平板，30 ℃培養(yǎng) 72 h，挑取單克隆，在MD平板上篩選His+表型，分別接種于G418的YPD培養(yǎng)基平板上，篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，對陽性重組子進行PCR鑒定。

1.5 Jztx-III的誘導(dǎo)表達

挑選陽性菌落，置于BMGY培養(yǎng)基中，每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%~1.0%。用15% Trincine-SDS-PAGE 檢測JZTX-III表達情況。

1.6 Jztx-III的分離純化

菌體發(fā)酵離心所獲得上清，經(jīng)Millipore 超濾管濃縮除鹽，利用High Affinity Ni-NTA Resin（南京金斯瑞）進行親和層析。洗脫產(chǎn)物由15% Trincine-SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 pPIC9k/Jztx-III表達載體構(gòu)建

根據(jù)敬釗毒素-III全長基因序列并依據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計合成敬釗毒素-III的全長DNA序列，與表達載體pPIC9k連接后，經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切及測序結(jié)果表明片段大小及序列與pPIC9k及Jztx-III大小相符。

2.2 pPIC9k/Jztx-III陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

pPIC9k/Jztx-III經(jīng)SacⅠ酶線性化后，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌GS115，并經(jīng)MD

平板、G418平板篩選獲得了多拷貝轉(zhuǎn)化子。選取其中8株His+陽性重組子進行PCR鑒定（圖1）。經(jīng)過PCR擴增后獲得2個片段，分別為2.2 kb的AOX基因和642 bp（Jztx-III+492kb側(cè)翼序列）片段，證明Jztx-III已經(jīng)整合入GS115基因組。

圖1pPIC9k/Jztx-III陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果

2.3 重組Jztx-III的分離純化

含有pPIC9k/Jztx-III的陽性菌落在BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)并甲醇誘導(dǎo)72 h后產(chǎn)量達到最高，利用High Affinity Ni-NTA Resin進行親和層析，樣品經(jīng)洗脫液洗脫后，15% Tricine-SDS-PAGE檢測（圖2），結(jié)果顯示，經(jīng)純化后獲得分子量為5 kD左右的多肽，該分子量與敬釗毒素-3理論值3.9 kD加0.84 kD的6×His標(biāo)簽相符。經(jīng)BCA法檢測發(fā)現(xiàn)，Jztx-III濃度可達到95 mg/L。

圖2 Tricine-SDS-PAGE 檢測純化的Jztx-III

3 結(jié)論與討論

蜘蛛毒素為富含二硫鍵的多肽，其分子量小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、體外的折疊效率比較低，因此很難通過化學(xué)合成的方法復(fù)現(xiàn)其功能區(qū)。采用基因工程方法，在體內(nèi)進行蜘蛛毒素的合成是一條理想的途徑。試驗選擇巴斯德畢赤酵母作為Jztx-III

的表達體系，其優(yōu)勢在于酵母表達系統(tǒng)是具有高效分泌的真核表達系統(tǒng)，可對目的蛋白進行翻譯后修飾，幫助敬釗毒素形成正確結(jié)構(gòu)。同時，為了進一步提高Jztx-III的表達量，試驗根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子對Jztx-III基因進行了優(yōu)化設(shè)計，并在其C-端添加了6×His標(biāo)簽，構(gòu)建了pPIC9k/Jztx-III表達載體，該標(biāo)簽的加入有利于表達后的分離純化且不對多肽的活性有影響。經(jīng)電轉(zhuǎn)化、甲醇誘導(dǎo)、High Affinity Ni-NTA純化后，Jztx-III可以成功在畢赤酵母GS115中表達，產(chǎn)量達到95 mg/L，實現(xiàn)了Jztx-III在畢赤酵母中得高效表達。而對于重組Jztx-III的生物學(xué)活性，有待于進一步┭芯俊＊

參考文獻

［1］ ORI M，IKEDA H.Spider venoms and spider toxins［J］.Journal of Toxicology-Toxin Reviews，1998，17(3):405-426.

［2］ RASH L D，HODGSON W C.Pharmacology and biochemistry of spider venoms［J］.Toxicon，2001，40(3):225-254.

［3］ XIAO Y C，TANG J Z，YANG Y J，et al.Jingzhaotox瞚n睮II，a novel spider toxin inhibiting activation of voltage瞘ated sodium channel in rat cardiac myocytes［J］.J Biol Chem，2004，279(25):26220-26226.