歐克緯 禤維言 王興偉 馮斗

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530004）お

摘要 ［目的］研究香蕉假莖外植體愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。［方法］以香蕉組培無(wú)菌苗假莖為外植體，接種在含不同濃度配比激素的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，再將培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。［結(jié)果］使用低濃度噻苯?。═DZ）誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的效果最好，最佳培養(yǎng)基為T2：MS+0.02 mg/L TDZ +7 mg/L 2，4睤。［結(jié)論］懸浮培養(yǎng)使用ZT2能較早建立ECS，且繼代效果較好。

關(guān)鍵詞 香蕉（玀usa nana Lour）；胚性愈傷組織；懸浮培養(yǎng)

中圖分類號(hào) SB188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06167-03

お

Study of Banana Cauloid Explant Callus Induction

OU Ke瞱ei et al

(Agriculture School of Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

Abstract ［Objective］ To study the optimum culture medium for banana cauloid explant callus induction. ［Method］ Using the banana cauloid which are germfree as the explants, inoculate them into the soil medium containing different kinds of the hormone. When we get the embryogenic callus, inoculate them into the liquid nutrient medium and conduct suspension culture. ［Result］ The test results showed that, when we use the TDZ with low concentration, the induction effects is the best. The best medium is T2: MS+ 0.02 mg/L TDZ +2,4睤 7 mg/L. ［Conclusion］ The best liquid nutrient medium is ZT2, as ZT2 could establish the ECS as soon as possible, and could get the best result.

Key words Banana; Embryogenic callus; Suspension culture

お

作者簡(jiǎn)介 歐克緯（1986- ），女，廣西桂林人，碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)育種。

收稿日期 20140529

香蕉（玀usa nana Lour）屬芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（玀usa）單子葉植物。食用蕉多為三倍體（包括AAA、ABB、ABB等基因型），具有高度的不育性。傳統(tǒng)的香蕉育種方法多為引種［1］，但長(zhǎng)久種植后香蕉品種會(huì)退化或者出現(xiàn)抗性衰弱等現(xiàn)象，很容易受到病害、蟲害以及寒害的威脅。如黑斑病、香蕉枯萎病、線蟲病和病毒病等［2］。所以，栽培和選育抗性強(qiáng)、具有優(yōu)良性狀的香蕉新品種就顯得尤為重要。香蕉體細(xì)胞胚的研究起步較晚，對(duì)此方面的研究報(bào)告也較少，研究進(jìn)展較為緩慢。雖然已建立了少數(shù)幾個(gè)品種的ECS［3-6］，但香蕉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)難度大、建立ECS的耗時(shí)長(zhǎng)［8］，且不同香蕉品種間差異顯著［4-6，8］。

試驗(yàn)針對(duì)矮蕉組培苗進(jìn)行切片并誘導(dǎo)，觀察不同激素配比（使用單一細(xì)胞分裂素或使用2種細(xì)胞分裂素）的培養(yǎng)基對(duì)香蕉假莖切片外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)的效果差異，篩選能誘導(dǎo)矮蕉產(chǎn)生胚性愈傷組織的最適合培養(yǎng)基以及進(jìn)行愈傷組織擴(kuò)繁的最適液體培養(yǎng)體系，以期為進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因創(chuàng)造具有優(yōu)良性狀的香蕉品種做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)所用香蕉無(wú)菌苗來(lái)自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，品種為矮蕉；以無(wú)菌苗假莖的莖段為外植體。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)菌苗，去除根部及葉片等后，將無(wú)菌苗假莖切塊，長(zhǎng)度為0.6 cm。分別接種于MS附加激素TDZ、6BA、ZT的培養(yǎng)基中（配方見表1）。每隔10 d觀察1次，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)各個(gè)培養(yǎng)基中外植體褐化塊數(shù)、愈傷組織塊數(shù)以及胚性愈傷組織塊數(shù)。計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率以及褐化率：愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織塊數(shù)/接種總塊數(shù)；胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=胚性愈傷組織塊數(shù)/接種總塊數(shù)；褐化率=褐化塊數(shù)/接種總塊數(shù)。

1.2.2 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基中瓊脂含量為7 g/L，蔗糖30 ゞ/L，pH為5.8，接種矮蕉每個(gè)配方10瓶，每瓶8塊外植體。接種后的外植體先暗培養(yǎng)3 d，再進(jìn)行光照培養(yǎng)，16 h/d，光照強(qiáng)度1 500~2 000 lx，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。

表1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基編號(hào) TDZ∥mg/L 6睟A∥mg/L ZT∥mg/L 2，4睤∥mg/L

T2 0.02 0 0 7.0

T3 0.50 0 0 7.0

T4 1.00 0 0 7.0

TB1 0.02 1.0 0 7.0

TB2 0.50 0.7 0 7.0

TB3 1.00 0.5 0 7.0

BZ1 0 1.0 1.0 7.0

BZ2 0 0.7 2.0 7.0

BZ3 0 0.5 4.0 7.0

XB3 0 1.0 0 5.0

XB4 0 1.0 0 7.0

1.2.3 胚性細(xì)胞懸浮系（ECS）的建立。60 d后挑取通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生的長(zhǎng)勢(shì)良好的胚性愈傷組織顆粒，分別放入50 ml的三角瓶中，加入不同濃度玉米素（ZT）的液體培養(yǎng)基10 ml，放入搖床中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基（不含鐵鹽和肌醇）；搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，光照16 h/d，光照強(qiáng)度為2 000 lx，培養(yǎng)溫度為（27±2）℃。不同ZT濃度液體培養(yǎng)基配制見表2。

お

表2 不同ZT濃度的液體培養(yǎng)基

養(yǎng)基編號(hào) Vitamin C∥mg/L 2，4睤∥mg/L ZT∥mg/L

ZT1 10.0 1.0 12.5

ZT2 10.0 1.0 25.0

ZT3 10.0 1.0 50.0

10 d后分別往各個(gè)培養(yǎng)基中加入10 ml對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基。20 d后吸取懸浮培養(yǎng)系的上清液，再加入對(duì)應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每隔10 d進(jìn)行1次繼代培養(yǎng)，60 d后肉眼觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 接種到各個(gè)不同培養(yǎng)基中的香蕉無(wú)菌苗假莖，20 d后外植體即出現(xiàn)較為明顯的膨大，30 d后部分外植體出現(xiàn)褐化，40 d后出現(xiàn)白色蓬松狀愈傷組織，40~50 d出現(xiàn)淡黃色或黃色的胚性愈傷組織（圖1）。培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)各個(gè)培養(yǎng)基中外植體的褐化數(shù)、愈傷組織數(shù)以及胚性愈傷組織數(shù)，并計(jì)算胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

由表3可知，只使用TDZ的T2、T3和T4培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，混合使用2種細(xì)胞分裂素的TB系列和以及單獨(dú)使用6睟A的XB系列培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率較低，

BZ系列的愈傷組織誘導(dǎo)率最低。使用低濃度TDZ的T2、T3

培養(yǎng)基及BZ2的培養(yǎng)基胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，均為

11.25%，只單獨(dú)添加6睟A的XB系列培養(yǎng)基及混合使用2種細(xì)胞分裂素的TB系列培養(yǎng)基胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均較低，而BZ3的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為0。褐化率最低的培養(yǎng)基則為T2。T3和BZ2培養(yǎng)基的褐化率均高于T2培┭基。

圖1 香蕉假莖誘導(dǎo)的愈傷組織

表3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基編號(hào) 接種外植體ぷ蓯∥塊 愈傷組織た 愈傷組織誘さ悸省% 胚性愈傷組ぶ∥塊 胚性愈傷組織び盞悸省% 褐化數(shù)た 褐化率%

T2 80 47 58.75 9 11.25 9 11.25

T3 80 54 67.50 9 11.25 26 32.50

T4 80 65 81.25 4 5.00 13 16.25

TB1 80 12 15.00 6 7.50 47 58.75

TB2 80 11 13.75 1 1.25 28 35.00

TB3 80 10 12.50 3 3.75 61 76.25

XB3 80 12 15.00 5 6.25 52 65.00

XB4 80 13 16.25 5 6.25 62 77.50

BZ1 80 5 6.25 1 1.25 37 46.25

BZ2 80 13 16.25 9 11.25 41 51.25

BZ3 80 1 1.25 0 0 40 50.00

2.2 胚性細(xì)胞懸浮系（ECS）的培養(yǎng) 胚性愈傷組織接種至不同濃度ZT的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，12 d后接種的胚性愈傷組織顆粒出現(xiàn)褐化，約30 d后懸浮系逐漸形成，60 d后懸浮細(xì)胞濃度較穩(wěn)定。

由表4可知，使用ZT2培養(yǎng)基（含25 mg/L ZT）懸浮培養(yǎng)的效果最好，也最早出現(xiàn)胚性細(xì)胞懸浮系（約為30 d），胚性細(xì)胞懸浮系的濃度較高，長(zhǎng)勢(shì)良好；ZT3培養(yǎng)基玉米素濃度最高，接種的胚性愈傷組織顆粒出現(xiàn)褐化的時(shí)間也最早（約為10 d），形成細(xì)胞懸浮系用時(shí)最長(zhǎng)（約為50 d），胚性細(xì)胞懸浮系濃度較低，長(zhǎng)勢(shì)一般；ZT1玉米素使用濃度最低，開始出現(xiàn)褐化的時(shí)間最長(zhǎng)（為14 d），開始出現(xiàn)胚性細(xì)胞懸浮系的時(shí)間也較晚（約為40 d），形成的胚性細(xì)胞懸浮系濃度不高，長(zhǎng)勢(shì)較好（圖2）。

お

表4 不同濃度ZT對(duì)懸浮培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基編號(hào) 開始出現(xiàn)褐化さ氖奔洹蝑 開始出現(xiàn)懸浮さ氖奔洹蝑 懸浮細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)

ZT1 14 40 ++

ZT2 12 30 +++

ZT3 10 50 +

注：“+”表示生長(zhǎng)情況一般，“++”表示生長(zhǎng)情況較好，“+++”表示生長(zhǎng)情況良好。お

圖2 香蕉胚性細(xì)胞懸浮系生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論與討論

使用矮蕉無(wú)菌苗假莖為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織以及建立ECS的時(shí)間均較長(zhǎng)，難度均較大，此領(lǐng)域的相關(guān)研究報(bào)告也較少。TDZ作為具有高活性的細(xì)胞分裂素可用于誘導(dǎo)香蕉等難以培養(yǎng)的植物。使用低濃度單一細(xì)胞分裂素TDZ時(shí)，矮蕉的假莖切片胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高?？赡苁怯捎赥DZ具有強(qiáng)細(xì)胞分裂素活性，較高濃度抑制胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)，這與劉曉光等［9］的觀點(diǎn)一致，他對(duì)棗葉愈傷組織的誘導(dǎo)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示TDZ濃度過(guò)高時(shí)誘導(dǎo)形成的愈傷組織質(zhì)硬且量少，出愈率低。配合使用其他細(xì)胞分裂素（6睟A，ZT）時(shí)也不利于矮蕉假莖愈傷組織的誘導(dǎo)，這可能與植物激素的種類、濃度以及它們之間的組合使用情況有關(guān)［10］。使用25 mg/L細(xì)胞分裂素ZT，胚性細(xì)胞懸浮系建立起來(lái)的時(shí)間最短，懸浮細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)也較好。低濃度ZT繼代的效果較差，而高濃度ZT有可能抑制胚性細(xì)胞懸浮系的生長(zhǎng)。故設(shè)定的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)矮蕉假莖切片胚性愈傷組織的最適宜培養(yǎng)基為T2培養(yǎng)基（MS+0.02 mg/L TDZ+ 7 mg/L 2，4睤），最適宜液體培養(yǎng)基為ZT2培養(yǎng)基（1/2MS大量元素+MS微量元素+ 10 mg/L V瑿+ 1.0 mg/L 24，D+25 mg/L ZT ）。

胚性愈傷組織既是誘導(dǎo)體胚再生植株的重要材料，又是原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞融合及外源基因轉(zhuǎn)化的理想材料［11］。總體來(lái)說(shuō)，香蕉胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較低（通常小于1%），且品種間差異大，只能從約1/5~1/2質(zhì)量好的胚性愈傷組織中獲得ESC［8］。試驗(yàn)只是針對(duì)矮蕉進(jìn)行了初步的研究，而如何篩選出適用于不同香蕉品種的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系仍需廣大科研工作者的不屑努力。

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