（湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南湘潭 411102）お

摘要 ［目的］檢測10個(gè)不同產(chǎn)地蓮子和蓮子心中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留。［方法］樣品采用超聲提取-磺化法或超聲振蕩提取睼arian柱提取純化，OV17毛細(xì)管柱程序升溫，外標(biāo)法定量，GC睧CD 測定了10個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子和蓮子心中六六六4種異構(gòu)體、滴滴涕4種異構(gòu)體和五氯硝基苯共9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留。［結(jié)果］9種有機(jī)氯農(nóng)藥在 1~250 μg/L 濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率在93.21%獈102.16%，10個(gè)產(chǎn)地的蓮子心中未檢測到有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，蓮子中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。［結(jié)論］建立了一套簡便、操作性強(qiáng)的蓮子和蓮子心中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的分析方法。

關(guān)鍵詞 蓮子；蓮子心；有機(jī)氯農(nóng)藥；殘留量；GC睧CD

中圖分類號(hào) SB567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06233-04

お

Determination of Organochlorine Pesticide Residues in 獿otus Seed and 玃lumula nelambinis from Different Field Origins

WU Mei瞦ing

(Xiangtan Vocational and Technical College, Xiangtan, Hunan 411102)

Abstract ［Objective］ To determine organochlorine pesticide residues in 獿otus seed and 玃lumula nelambinis from ten field origins. ［Method］ After the organochlorine pesticide residues were extracted from 獿otus seed and 玃lumula nelambinis by ultrasonic extraction瞫ulfonation or oscillating ultrasonic extraction睼arian column. OV17 capillary column was used and the external standard method was applied to quantify the pesticides. At last GC睧CD is adopted to detect 9 organochlorine pesticide residues such as 4 BHC isomers and 4 DDT isomers and PCNB. ［Result］ 9 organochlorine pesticides showed a good linear relationship in the concentration range of 1-250 μg/L, the average recovery was 93.21%-102.16%. It is found that there are no residues of organochlorine detected from 玃lumula nelambinis samples from ten field origins. Organochlorine pesticide residues in 獿otus 玸eeds are far below the “Chinese Pharmacopoeia” standard. ［Conclusion］ The established analysis method is simple and practically for determining organochlorine pesticide residues in 獿otus seed and 玃lumula nelambinis.

Key words 獿otus seed; 玃lumula nelambinis; Organochlorine pesticide; Residue level; GC睧CD

基金項(xiàng)目 湖南省衛(wèi)生廳廳基金研究項(xiàng)目（B2012143）。

作者簡介 吳梅青（1971-），女，湖南湘潭人，副教授，從事天然產(chǎn)物研究與分析。

收稿日期 20140529

目前，中藥材中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，不僅影響藥材的質(zhì)量，而且成為中藥材走向世界的“瓶頸”，各國均采取了嚴(yán)格措施對(duì)進(jìn)口中藥材進(jìn)行審查和檢測，部分國家已對(duì)我國中藥材的出口設(shè)置了重重技術(shù)壁壘。我國現(xiàn)用農(nóng)藥種類眾多，有機(jī)氯農(nóng)藥是其中的一大類，屬高毒、高殘留品種，主要包括滴滴涕（DDT）、六六六（BHC）、五氯硝基苯（PCNB）等。該類農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易揮發(fā)、氧化和分解，易在生物體富集，對(duì)自然環(huán)境和人類健康造成極大危害，故各國對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥在食品中的殘留控制甚嚴(yán)。我國已在1983年禁止使用六六六、滴滴涕等有機(jī)氯農(nóng)藥，但目前仍能在中藥材、水、土壤中檢測到［1-3］。因此，監(jiān)測中藥材中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留和制定限量標(biāo)準(zhǔn)十分必要。

蓮子（玁elumbo nucifera 獹aertn.）為睡蓮科植物的成熟種子，主產(chǎn)于湖南、湖北、浙江、江蘇等地。蓮子心是其成熟種子中的干燥幼葉及胚根。蓮子具有補(bǔ)脾止瀉、止帶、益腎澀精、養(yǎng)心安神作用，用于脾虛泄瀉、帶下、遺精、心悸失眠。蓮子心具有清心安神、交通心腎、澀精止血等作用，用于熱入心包、神昏譫語、心腎不交、失眠遺精以及血熱吐血［4］。蓮子和蓮子心屬藥食同源的中藥，是老少皆宜的滋補(bǔ)品，臨床應(yīng)用十分廣泛，而且被人們廣泛應(yīng)用于食品中。但蓮是多年生宿根水生植物，生于水澤、池塘、湖沼或水田內(nèi)，野生或栽培，有可能受有機(jī)氯農(nóng)藥污染而影響其安全性，故有必要對(duì)其進(jìn)行有機(jī)氯農(nóng)藥殘留測定，了解其在種植、運(yùn)輸、加工過程中受到農(nóng)藥污染的情況。為此，筆者參照《中國藥典》（2010年版）附錄“有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測定”方法和《中國農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編》*農(nóng)藥殘留卷*（上）“有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測定”中樣品前處理方法，采用OV17毛細(xì)管柱程序升溫，外標(biāo)法定量，GC睧CD 測定了10個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子和蓮子心中9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量，旨在為其安全性控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試植物。蓮子和蓮子心藥材購自湖南省藥材市場，產(chǎn)地分別為湖南湘潭、湖南常德、湖南漢壽、湖南衡陽、湖南耒陽、湖南華容、江蘇淮陰、浙江宣平、湖北洪湖和福建建寧，上述10個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子和蓮子心均由湖南省中醫(yī)藥研究所李若存教授鑒定為蓮科植物種子和種子的幼葉及胚根。

1.1.2 藥劑與試劑。BHC 4 種異構(gòu)體（α睟HC、β睟HC、γ睟HC、δ睟HC）、DDT 4 種異構(gòu)體（P，P′睤DE、O，P′睤DT、P，P′睤DD、P，P′睤DT）、五氯硝基苯（PCNB）均購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；丙酮、石油醚（60~90 ℃）為色譜純；水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.1.3

主要儀器。氣相色譜儀（日本島津公司），OV17毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm×0.50 μm），ECD 檢測器；Varian固相萃取小柱；DS8510DT型超聲波清洗儀（上海暉研儀器設(shè)備有限公司）；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限┕司）。

1.2 方法

1.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備。稱取 BHC 4 種異構(gòu)體（α睟HC、β睟HC、γ睟HC、δ睟HC）、DDT 4 種異構(gòu)體（P，P′睤DE、O，P′睤DT、P，P′睤DD、P，P′睤DT）、五氯硝基苯對(duì)照品適量，用石油醚分別配制成 20 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。量取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 ml置于10 ml量瓶中，用石油醚稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為20 μg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用石油醚分別制成質(zhì)量濃度為 0、1、5、10、50、100、250 μg/L的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備。

1.2.2.1 超聲提取-磺化法。分別稱取適量蓮子和蓮子心于60 ℃干燥4 h，粉碎成細(xì)粉，各稱取2 g置于100 ml具塞錐形瓶中，加水20 ml浸泡過夜，加丙酮40 ml，稱重量，超聲處理30 min，放冷，再稱重量，用丙酮補(bǔ)足減失的重量，再加氯化鈉6 g及二氯甲烷30 ml，稱重量，超聲處理15 min，再稱重量，用二氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，靜置分層，將有機(jī)相迅速移入裝有適量無水硫酸鈉的100 ml具塞錐形瓶中，放置4 h。量取35 ml，于40 ℃水浴上減壓濃縮至近干，加少量石油醚如上述反復(fù)操作至二氯甲烷及丙酮除凈，用石油醚溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml具塞刻度離心管中，加石油醚至5 ml。小心加入硫酸1 ml，振搖1 min，3 000 r/min離心10 min。用滴管取出上清液，待檢測。

1.2.2.2 超聲振蕩提取睼arian柱凈化法。分別稱取蓮子和蓮子心樣品20 g于研缽中，加入無水硫酸鈉研磨至水分近干，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入50 ml石油醚-丙酮溶液（1∶1,￢/V），超聲振蕩提取50 min，靜置15 min，提取液經(jīng)抽濾后，濾液收集于50 ml容量瓶中，殘?jiān)礈旌笠徊V入，定容。取濾液10 ml于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（45 ℃）吹干，加入2 ml石油醚溶解樣品。在Varian固相萃取小柱中加入2 cm高無水硫酸鈉，取20 ml淋洗液［石油醚-丙酮（9∶1，玍/V）］淋洗小柱，棄淋洗液，柱面上留少量液體，將提取的樣品加入已淋洗過的層析柱上，用50 ml淋洗液洗脫，收集洗脫液于150 ml錐形瓶中，將凈化液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再用5 ml石油醚定容，加無水硫酸鈉3 g至錐形瓶中，微振溶解，用橡膠塞蓋緊錐形瓶，以備進(jìn)樣。

1.2.3 氣相色譜條件。色譜柱：OV17毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm×0.50 μm）；柱升溫程序：120 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min，以8 ℃/min升至250 ℃，再保持15 min；檢測器溫度：300 ℃；載氣：高純氮，純度大于99.999%；流量：1.0 ml/min；進(jìn)樣方式：恒流模式，不分流；進(jìn)樣量：1 μl。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 線性關(guān)系考察。量取“1.2.1”項(xiàng)下質(zhì)量濃度不同的混合對(duì)照品溶液，按“1.2.3”氣相色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積（珁）為縱坐標(biāo)，濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求取回歸方程。

1.2.4.2 檢出限的確定。按照“1.2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，不加蓮子和蓮子心樣品制備空白樣品溶液。吸取空白樣品溶液、有機(jī)氯農(nóng)藥混合對(duì)照品溶液（1 μg/ml）1 μl注入氣相色譜儀進(jìn)行測定。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)。吸取50 μg/L混合對(duì)照品溶液1 μl，按“1.2.3”氣相色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（玆SD）。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別吸取湖南湘潭產(chǎn)蓮子和蓮子心供試品溶液1 μl，按“1.2.3”氣相色譜條件8 h內(nèi)間隔進(jìn)樣5次，測定峰面積。

1.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)。稱取湖南湘潭產(chǎn)蓮子樣品，按“1.2.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別加入3種不同濃度（5、50、100 μg/L）的有機(jī)氯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度重復(fù)測定5次，按“1.2.3”氣相色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率。

1.2.5 樣品中農(nóng)藥殘留量的測定。稱取10個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子和蓮子心樣品適量，按“1.2.2.1”和“1.2.2.2”項(xiàng)下分別對(duì)樣品進(jìn)行前處理，再按“1.2.3”氣相色譜條件測定，分別吸取樣品溶液和與之相對(duì)應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液各1 μl，分別連續(xù)進(jìn)樣3次，取3次平均值，按外標(biāo)法計(jì)算10種不同產(chǎn)地樣品中9種農(nóng)藥殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系 由表1可知，9種有機(jī)氯農(nóng)藥在1~250 │蘥/L 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系?；鞓?biāo)對(duì)照品、樣品氣相色譜分別見圖1~3。

表1 9 種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)溶液組分 保留時(shí)間//min 線性回歸方程 相關(guān)系數(shù)

α睟HC 15.506 珁=1 274.7x+1 471.7 0.999 6

β睟HC 16.726 珁=583.81x+21 914 0.992 5

γ睟HC 16.976 珁=883.09x+7 284.2 0.993 0

δ睟HC 18.056 珁=968.39x+12 242 0.990 9

P,P′睤DE 25.709 珁=753.84x+9 241.2 0.990 8

P,P′睤DD 27.667 珁=628.02x+3 397 0.997 8

O,P′睤DT 27.823 珁=414.62x+3 841.9 0.993 2

PP′睤DT 29.845 珁=363.7x-202.87 0.998 7

PCNB 17.209 珁=1 333.3x+13 789 0.994 4

注：1.α睟HC；2.β睟HC；3.γ睟HC；4.PCNB；5.δ睟HC；6.P，P′睤DE；7.O，P′睤DT；8.P，P′睤DD；9.P，P′睤DT。

圖1 9 種有機(jī)氯農(nóng)藥混標(biāo)對(duì)照品氣相色譜

2.2 檢出限 結(jié)果表明，以信噪比（S/N）3∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度為最低檢出限，測得 α睭CH、β睭CH、γ睭CH、δ睭CH、P，P′睤DE、O，P′睤DT、P，P′睤DD、P，P′睤DT 和PCNB 9種有機(jī)氯農(nóng)藥檢出限分別為6、4、4、12、5、20、3、5、5 μg/L。

2.3 精密度 結(jié)果表明，α睭CH、β睭CH、γ睭CH、δ睭CH、P，P′睤DE、O，P′睤DT、P，P′睤DD、P，P′睤DT和PCNB的峰面積玆SD分別為1.86%、2.47%、2.86%、1.45%、1.24%、2.02%、1.32%、1.98%和2.64%，表明該方法精密度良好。

圖2 蓮子樣品氣相色譜

圖3 蓮子心樣品氣相色譜

2.4 穩(wěn)定性 結(jié)果表明，測得α睟HC峰面積的玆SD分別為1.66%和1.32%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率 由表2可知，9種農(nóng)藥成分的平均回收率在93.21%~102.16%（玭=5），玆SD在2.0%~4.5%，表明該方法能滿足農(nóng)藥殘留量分析要求。

表2 9種有機(jī)氯農(nóng)藥的回收率

%

組分 5 μg/L回收率 玆SD

50 μg/L回收率 玆SD

100 μg/L回收率 玆SD

α睟HC 98.45 3.6 96.27 3.8 99.34 3.0

β睟HC 97.67 2.8 99.14 3.5 98.93 4.5

γ睟HC 99.76 4.2 100.20 3.9 99.05 3.0

δ睟HC 101.54 3.5 99.87 4.8 98.52 3.7

PP′睤DT 93.21 2.3 96.46 3.3 97.56 3.4

PP′睤DD 96.41 3.5 99.87 4.0 97.63 4.2

OP′睤DT 98.89 4.1 97.67 4.2 102.16 4.3

PP′睤DT 99.02 3.9 98.83 2.9 98.67 3.8

PCNB 97.87 2.0 99.77 3.2 99.79 4.1

2.6 樣品中農(nóng)藥殘留量 由表3可知，10種不同產(chǎn)地的蓮子樣品中，測得湖南耒陽的蓮子中PP′睤DE、PCNB含量分別為0.003、0.005 mg/L；江蘇淮陰的蓮子中δ睟HC含量為0.002 mg/L；浙江宣平的蓮子中PP′睤DD含量為0.007 ﹎g/L；其他蓮子樣品中均未檢出。10個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子心樣品中均未檢出9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留。

表3 蓮子和蓮子心樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量測定結(jié)果

mg/L

樣品 產(chǎn)地 α睟HC β睟HC γ睟HC δ睟HC PP′睤DE PP′睤DD OP′睤DT PP′睤DT PCNB

蓮子 湖南湘潭 － － － － － － － － －

蓮子 湖南常德 － － － － － － － － －

蓮子 湖南漢壽 － － － － － － － － －

蓮子 湖南衡陽 － － － － － － － － －

蓮子 湖南耒陽 － － － － 0.003 － － － 0.005

蓮子 湖南華容 － － － － － － － － －

蓮子 江蘇淮陰 － － － 0.002 － － － － －

蓮子 浙江宣平 － － － － － 0.007 － － －

蓮子 湖北洪湖 － － － － － － － － －

蓮子 福建建寧 － － － － － － － － －

蓮子心 湖南湘潭 － － － － － － － － －

蓮子心 湖南常德 － － － － － － － － －

蓮子心 湖南漢壽 － － － － － － － － －

蓮子心 湖南衡陽 － － － － － － － － －

蓮子心 湖南耒陽 － － － － － － － － －

蓮子心 湖南華容 － － － － － － － － －

蓮子心 江蘇淮陰 － － － － － － － － －

蓮子心 浙江宣平 － － － － － － － － －

蓮子心 湖北洪湖 － － － － － － － － －

蓮子心 福建建寧 － － － － － － － － －

注：“－”表示未檢出。

3 討論

農(nóng)藥殘留量測定中，2010版《中國藥典》規(guī)定了有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量的測定方法，包括六六六、滴滴涕和五氯硝基苯。規(guī)定甘草和黃芪的限量為總BHC≤0.20 mg/L，總DDT≤ 0.20 mg/L，PCNB≤0.10 mg/L［4］。英、美和歐洲藥典規(guī)定了有機(jī)氯類農(nóng)藥的限量：六六六0.3 mg/kg，五氯硝基苯1.0 mg/kg，滴滴涕1.0 mg/kg［5-7］。該研究表明，10個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子心樣品中均未檢出9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留；10個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子樣品中，有7個(gè)產(chǎn)地的未檢測出有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，有3個(gè)產(chǎn)地的樣品中檢測到滴滴涕和五氯硝基苯，但含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于中、英、美及歐洲藥典規(guī)定的要求，說明不同產(chǎn)地的蓮子和蓮子心藥材在種植、加工、運(yùn)輸過程中幾乎未受到有機(jī)氯農(nóng)藥污染，藥材使用的安全性好。

由于蓮子和蓮子心屬藥食同源的中藥材，故該試驗(yàn)中對(duì)供試品溶液的制備采用超聲提取-磺化法和超聲振蕩提取-Varian柱凈化法2種方法。第1種方法參照的是2010版《中國藥典》中有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測定中的方法，用濃硫酸凈化可除去提取中的色素、脂溶性物質(zhì)等各種干擾雜質(zhì)，但樣品中可能帶有強(qiáng)酸物質(zhì)，對(duì)色譜柱有損傷，而且試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)檢測到的樣品圖譜中雜質(zhì)干擾峰較多，且操作過程較繁瑣，試劑用量較多。第2種方法參照2010年版《中國農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編》*農(nóng)藥殘留卷（上）中有關(guān)有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測定方法，溶劑用量減少，操作簡便，采用Varian固相萃取小柱分離，測定時(shí)雜質(zhì)峰也減少了。但用2種方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理后檢測到的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn)

［1］ 隆穎，栗建明，陳浩桉，等.毛細(xì)管氣相色譜法測定半夏中20種有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（5）：528-530.

［2］ 劉芃巖，杜國棟，劉微，等.超聲波萃取氣相色譜法測定土壤樣本中16種有機(jī)氯農(nóng)藥［J］.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，12（5）：394-396.

［3］ 劉小真，趙慈，梁越，等.贛江流域底泥中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留特征及空間分布［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（9）：2863-2871.

［4］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄57，256-257.

［5］ British Pharmacopoeia Commission British Pharmacopoeia［S］.London：States Pharmacopeial Commission，2000：Appendix，81.

［6］ The United States Pharmacopeial Convention.U.S.Pharmacopeia（24）/National Formulary（19）［S］.Philadelphia PA：States Pharmacopeial Convention，2000：19.

［7］ Council of Europe.European Pharmacopoeia［S］.Strasbourg：States Pharmacopeial Convention，2011：242.