金夷 周小玲 翟竟余等

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摘要 [目的]探究制藥廢水中活的但非可培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)細(xì)菌的組成與系統(tǒng)關(guān)系。[方法]利用土質(zhì)濾材構(gòu)建生物反應(yīng)器，基于復(fù)蘇促進(jìn)因子（resuscitation promoting factor，Rpf） 對(duì)VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇刺激生長(zhǎng)作用，采用MPN （most probable number） 法，稀釋平板法分離其中復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC菌株并解析其16S rRNA基因系統(tǒng)關(guān)系。[結(jié)果]在MPN培養(yǎng)系中，Rpf對(duì)部分細(xì)菌有生長(zhǎng)刺激作用。制藥廢水中存在對(duì)Rpf敏感、復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC優(yōu)勢(shì)菌群；制藥廢水中對(duì)Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有革蘭氏陽(yáng)性放線菌Microbacterium、Gordonia和Leucobacter屬近緣菌，革蘭氏陰性菌Candidimonas、Xanthobacter和Aminobacter屬近緣菌，其中菌株ZYM1、ZYM3、ZYZR4和ZYXR1可能屬于新種。[結(jié)論]研究結(jié)果揭示了制藥廢水中存在VBNC狀態(tài)細(xì)菌，為研究其形成機(jī)理、復(fù)蘇活性化機(jī)制以及制藥廢水的深度處理等提供重要的思路與方法。

關(guān)鍵詞 制藥廢水；生物反應(yīng)器；VBNC菌；Rpf；16S rRNA基因序列系統(tǒng)關(guān)系

中圖分類號(hào) S181.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）11-3156-04

Abstract [Objective] To investigate the composition and phylogenetic relationship of viable but nonculturable bacteria in pharmaceutical wastewater. [Method] Applied soil filter to build the bioreactor， then used resuscitation promoting factor （Rpf） which promoted the resuscitation and growth of VBNC bacteria， combined with most probable number （MPN） method and dilution

plating to isolate the VBNC bacteria and analyzed 16S rRNA gene phylogenetic relationship. [Result] In MPN culture system， Rpf could promote the resuscitation and growth of some bacteria. There were VBNC advantage floras that sensitive to Rpf in pharmaceutical wastewater. The major culturable VBNC bacteria in pharmaceutical wastewater belonged to the high GC gram positive actinomycetes including genera Microbacterium， Gordonia and Leucobacter， and negative bacteria including genera Candidimonas， Xanthobacter， Aminobacter. There were 4 strains ZYM1， ZYM3， ZYZR4 and ZYXR1 could be potential novel species. [Conclusion] This research revealed there were VBNC bacteria in pharmaceutical wastewater. These results can provide important ideas and methods for further study on VBNC bacteria of the pharmaceutical wastewater， especially the formation mechanism and recovery mechanism of VBNC bacteria and the advanced degradation process improvement of pharmaceutical wastewater.

Key words Pharmaceutical wastewater； Bioreactor； VBNC bacteria； Rpf； 16S rRNA phylogenetic relationship

近幾十年來(lái)，隨著人類對(duì)藥品需求量的快速增長(zhǎng)，制藥行業(yè)的迅猛發(fā)展導(dǎo)致了大量混合制藥廢水的排放。制藥廢水中含有高濃度的懸浮物、鹽、難熔化合物、毒性物質(zhì)、有機(jī)和無(wú)機(jī)物等，且化學(xué)需氧量高，化學(xué)法與物理法都難處深度處理制藥廢水[1]，所以高效微生物處理技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)。利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)從環(huán)境中能分離培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的0.01%～10.00%[2]，其他為未培養(yǎng)或活的但非可培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)細(xì)菌，表明環(huán)境中絕大部分微生物尚處于未知狀態(tài)。

自從1982年Xu等首次在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)生存但不可培養(yǎng)的霍亂弧菌和大腸桿菌后，至今國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了VBNC菌的相關(guān)內(nèi)容[3]。細(xì)菌由于多種因素導(dǎo)致進(jìn)入VBNC狀態(tài)，且仍具有生物活性但用常規(guī)培養(yǎng)法無(wú)法檢出，在一定條件下可以復(fù)蘇并保持原有功能[4]。1998年Mukamolova等報(bào)道了藤黃微球菌（Micrococcus luteus）分泌的一種蛋白質(zhì)能使該菌以及近緣的分枝桿菌（Mycobacterium）屬的一些處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞復(fù)蘇成為可培養(yǎng)化，這種蛋白質(zhì)被命名為復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf （resuscitation promoting factor）[5]。已有研究表明，Rpf能復(fù)蘇刺激大量革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，包括Mycobacterium、Rhodococcus、Arthrobacter、Leifsonia、Bacillus、Nocardia、Kitasatospora、Streptomyces和Paenibacillus屬的細(xì)菌[2-6]。丁林賢等研究表明，Rpf對(duì)難培養(yǎng)微好氧貧營(yíng)養(yǎng)革蘭氏陰性菌Curvibacter fontanus具有良好的促進(jìn)生長(zhǎng)的功能[7]。目前，對(duì)于Rpf及VBNC菌的研究主要集中在醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、病原菌分子遺傳學(xué)等，其他領(lǐng)域尚少見有報(bào)道。2013年蘇等綜述了丁等人在近10年對(duì)于VBNC細(xì)菌以及在環(huán)境治理與修復(fù)中所起潛在功能的研究，揭示了Rpf對(duì)挖掘環(huán)境微生物資源的特殊利用價(jià)值[8-9]。筆者從微生物學(xué)角度深入研究污水處理系統(tǒng)中VBNC菌體的形成機(jī)理，以期為挖掘Rpf及其VBNC微生物資源的可利用性等提供重要的研究思路與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。制藥廢水，采集于浙江省某制藥公司經(jīng)前處理的廢水，經(jīng)生物反應(yīng)器（串聯(lián)多塔式）連續(xù)流運(yùn)行30、61、183和361 d，分別從生物反應(yīng)器最初出水段三點(diǎn)取樣共取3 g（折算為干重）至滅菌的100 ml錐形瓶中，加入27 ml滅菌蒸餾水?dāng)嚢?0 min均勻制成懸液待用。

1.1.2 試驗(yàn)菌種。藤黃微球菌Micrococcus luteus IAM 14879（=NCIMB 13267），由東京大學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)研究所國(guó)際菌種保藏中心提供。依據(jù)研究介紹的方法制備M.luteus的DNA，確定rpf 基因并在大腸桿菌中表達(dá)。rpf基因陽(yáng)性菌的培養(yǎng)液離心經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾，作為含Rpf的試驗(yàn)處理組添加材料[6]。

1.1.3 主要儀器。PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（TP600），購(gòu)自日本Takara公司；凝膠成像系統(tǒng)（GelDocIt）

，購(gòu)自美國(guó)UVP公司；酶標(biāo)儀（1510），購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.1.4 主要試劑。UNIQ10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，16S rRNA基因PCR擴(kuò)增所用酶、引物和試劑，均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備。MPN培養(yǎng)系液體培養(yǎng)基為反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，其組成為（g/L）：KNO3 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，酒石酸鉀鈉 20.0 g，pH 7.2，121 ℃，15 min高壓滅菌。MPN培養(yǎng)系分離純化用PYM培養(yǎng)基組成（g/L）：蛋白胨 5.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，酵母膏3.0 g，瓊脂 20.0 g，pH 7.0～7.2，121 ℃，15 min高壓滅菌。

1.2.2 MPN法和MPN培養(yǎng)系。利用MPN法[10]和MPN培養(yǎng)系計(jì)數(shù)樣品可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)。以2.5～5.0 ml透明玻璃瓶作為培養(yǎng)容器，添加濃度10%含Rpf制備液至液體培養(yǎng)基中作為處理組，以添加等量不含Rpf制備液作為對(duì)照組，將以濃度10%的樣品懸液，以10倍濃度梯度稀釋到10-6，每組重復(fù)3次，30 ℃靜置培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間測(cè)定處理組與對(duì)照組吸光值的變化（OD660），并以O(shè)D660值以及肉眼判斷，記錄處理組與對(duì)照組培養(yǎng)液的渾濁情況，渾濁為陽(yáng)性，不渾濁為陰性。利用MPN表查出MPN值對(duì)應(yīng)的處理組與對(duì)照組中的細(xì)菌總數(shù)。

1.2.3 Rpf閾值與VBNC狀態(tài)菌的判斷。以處理組與對(duì)照組MPN值分別對(duì)應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)之比作為Rpf閾值VR。當(dāng)VR>5時(shí)（95%置信度），處理組的最前方某稀釋段培養(yǎng)液渾濁（陽(yáng)性），而對(duì)照組與之相同稀釋段為不渾濁 （陰性）時(shí)，處理組渾濁培養(yǎng)液經(jīng)稀釋平板分離，純化所得的菌為單位樣品中總數(shù)處于優(yōu)勢(shì)的VBNC狀態(tài)菌。當(dāng)5>VR≥1時(shí)，處理組與對(duì)照組最前端渾濁的培養(yǎng)液分別進(jìn)行稀釋平板分離，判斷對(duì)照組與處理組菌落形態(tài)特征的差異，認(rèn)為處理組中特有的特征性菌落為Rpf敏感的VBNC菌。

1.2.4 菌株分離純化與保存。經(jīng)3～10 d靜置培養(yǎng)并視MPN值趨于穩(wěn)定時(shí)，將處理組與對(duì)照組中最先端呈渾濁的培養(yǎng)液稀釋，利用平板分離法篩選、純化獲得相應(yīng)的可培養(yǎng)化細(xì)菌。將純化的細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)用于細(xì)菌鑒定，以及添加10%的甘油做成冷凍甘油管在-80 ℃保存。

1.2.5 分離菌株16S rRNA 基因序列與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建?？膳囵B(yǎng)化VBNC菌株的DNA提取按照生工UNIQ10 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物7f （5′CAGAGTTTGATCCTGGCT3′） 和1540r （5′AGGAGGTGATCC AGCCGCA3′）。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，根據(jù)結(jié)果切割所需DNA目的條帶，用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，PCR純化產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序所得菌株16S rRNA基因序列結(jié)果在DDBJ登錄取得菌株登錄號(hào)碼，在國(guó)際基因庫(kù)NCBI和EzTaxon server中進(jìn)行序列同源性檢索，挑選同源性高的典型菌株的16S rRNA基因序列為參比菌種，利用MEGA 5，按照NeighborJoining法聚類，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 MPN培養(yǎng)系中MPN值與樣品細(xì)菌總數(shù) 從制藥廢水連續(xù)流生物反應(yīng)器中取樣4次，MPN培養(yǎng)系中處理組與對(duì)照組的MPN值與每克樣品中的細(xì)菌總數(shù)見表1，通過(guò)VBNC的復(fù)活率證實(shí)制藥廢水中存在利用一般培養(yǎng)基不能檢出，但添加Rpf后對(duì)其敏感能復(fù)蘇生長(zhǎng)成為可培養(yǎng)化的VBNC狀態(tài)細(xì)菌。

2.2 Rpf閾值及其培養(yǎng)液OD660值的變化 反應(yīng)器運(yùn)行30、61、183和361 d所取樣構(gòu)建的MPN培養(yǎng)體系的Rpf閾值VR分別為16.0，55.8，2.2和1.9，表明制藥廢水生物反應(yīng)器中，取樣點(diǎn)單位樣品中存在對(duì)Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢(shì)菌群。圖1表明，培養(yǎng)系中各稀釋段培養(yǎng)液的OD660值，處理組均大于對(duì)照組，表明Rpf對(duì)培養(yǎng)系中的細(xì)菌有生長(zhǎng)刺激作用。

2.3 分離菌株的16S rRNA基因序列同源性與系統(tǒng)樹構(gòu)建 分離純化菌種經(jīng)測(cè)序后，利用國(guó)際基因庫(kù)NCBI和EzTaxon server進(jìn)行序列同源性檢索，各分離菌株的檢索結(jié)果見表2。處理組中分離到的菌株類型更為豐富，其中Candidimonas、Microbacterium、Gordonia、Aminobacter、Xanthobacter和Leucobacter屬的近緣菌ZYM1、ZYM3、ZYZR2、ZYZR4、ZYYR1、ZYYR2、ZYYR3和ZYXR1在對(duì)照組同等數(shù)量級(jí)培養(yǎng)液中未發(fā)現(xiàn)，因而這些細(xì)菌可視為經(jīng)Rpf復(fù)蘇生長(zhǎng)促進(jìn)作用成為可培養(yǎng)化的VBNC細(xì)菌。

4個(gè)階段所分離的17株細(xì)菌屬于Proteobacteria門和Actinobacteria門的兩大系統(tǒng)發(fā)育類群，包含了高GC的革蘭氏陽(yáng)性菌的放線菌和革蘭氏陰性菌，共7個(gè)科10個(gè)屬，挑選同源性高的典型菌株的16S rRNA基因序列為參比菌種，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

2.4 新種水平菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)關(guān)系解析 細(xì)菌多相分類學(xué)鑒定程序中，16S rRNA基因序列相似性在97% （或98%） 以下一般認(rèn)為有可能是新種。17株分離菌株中發(fā)現(xiàn)菌株ZYM1、ZYM3、ZYZR4、ZYYR1、ZYYNR1和ZYXR1與已知近緣菌的同源性較低，可能有存在較大的遺傳差異。特別是ZYM1、ZYM3、ZYZR4和ZYXR1這4株細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)樹分析后發(fā)現(xiàn)極可能代表新的分類單元。菌株ZYM1的最近近緣標(biāo)準(zhǔn)菌是Candidimonas nitroreducens SC089T （FN556191），序列相似性為 97.8%，菌株ZYM3的最近標(biāo)準(zhǔn)菌也是Candidimonas nitroreducens SC089T （FN556191），序列相似性為 97.4%，但從系統(tǒng)樹（圖2）中發(fā)現(xiàn)菌株ZYM1，ZYM3與Pusillimonas terrae AS85T （AB727962）離得最近，且這3株菌單獨(dú)構(gòu)成了一個(gè)進(jìn)化分支，表明菌株ZYM1和ZYM3是新種的概率很高。菌株ZYZR4的最近標(biāo)準(zhǔn)菌是Gordonia otitidis IFM 10032T （AB122026），序列相似性為96.6%，且在系統(tǒng)樹單獨(dú)形成進(jìn)化分支，差異性顯著達(dá)新種水平。菌株ZYXR1的最近標(biāo)準(zhǔn)菌是Leucobacter aridicollis CIP 108388T （AJ781047），序列相似性為 97.3%，但從系統(tǒng)發(fā)育樹中發(fā)現(xiàn)菌株ZYXR1單獨(dú)形成進(jìn)化分支，有可能是Leucobacter屬下的一個(gè)新種。對(duì)于分離到的這4株可培養(yǎng)化VBNC菌株我們將從多相分類學(xué)角度綜合它們的形態(tài)特征、生理生化、化學(xué)分類和相關(guān)參比菌株的DNDDNA同源性以及其他關(guān)聯(lián)基因等進(jìn)化關(guān)系分析進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

3 結(jié)論與討論

研究報(bào)道了在土壤與城市污水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)基于Rpf復(fù)蘇可培養(yǎng)化近緣的放線菌，具有較強(qiáng)的硝化反硝化、生物除臭功能以及利用Rpf分離到的VBNC菌具有較強(qiáng)的生物絮凝作用[11-12]。蘇等報(bào)導(dǎo)了從研究電器和電子廢物的多氯聯(lián)苯PCBs降解過(guò)程中發(fā)現(xiàn)活化的VBNC優(yōu)勢(shì)菌能使PCBs達(dá)到近乎100%的降解效果，揭示了Rpf與VBNC資源菌種的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[9]。試驗(yàn)對(duì)可培養(yǎng)化VBNC優(yōu)勢(shì)菌種ZYM1、ZYM3、ZYZR2、ZYZR4、ZYYR1、ZYYR2、ZYYR3和ZYXR1的已知近緣菌種的功能進(jìn)行了資料檢索分析，推測(cè)其可能具有的潛在環(huán)境功能。除了菌株ZYM1和ZYM3的近緣菌在國(guó)內(nèi)外尚未見有相關(guān)環(huán)境功能的報(bào)道外，菌株ZYZR2、ZYZR4、ZYYR1、ZYYR2、ZYYR3和ZYXR1的近緣菌種對(duì)于制藥廢水中存在的木質(zhì)素、酚類化合物、纖維素、鹵代甲烷、菲、芘、萘、二苯并噻吩、甲基氯、乙烯等都有較強(qiáng)的降解功能，并且對(duì)于一些難降解農(nóng)藥甲胺磷及其他一些環(huán)境污染物都表現(xiàn)出了可觀的降解作用[12-14]，對(duì)此試驗(yàn)將在以后的VBNC菌種的形成機(jī)理、潛在機(jī)能等探索試驗(yàn)中予以深入研究?；谏锓磻?yīng)器利用Rpf從制藥廢水中分離出VBNC菌株為深入研究與重新認(rèn)識(shí)環(huán)境生態(tài)中微生物復(fù)合群集組成，形成機(jī)理，復(fù)蘇活性化機(jī)制，直接獲得微生物菌種資源以及類似難降解制藥廢水深度降解工程工藝的改進(jìn)等研究提供重要的思路與方法。

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