封潔瓊等

摘要 [目的]通過比較水稻OsmiR156組成型過表達(dá)材料D18p、OsmiR156莖稈特異性過表達(dá)材料Ubi1及其親本日本晴分蘗期的生理生化特性，為產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供依據(jù)。[方法]設(shè)計隨機土壤盆栽試驗，測定分蘗期的生物學(xué)特性。[結(jié)果]分蘗初期，3種材料的分蘗數(shù)和株高沒有顯著差異（P>0.05）。在分蘗中后期D18p和Ubi1的分蘗數(shù)高于日本睛，而株高低于日本睛。在分蘗后期，3種材料中Ubi1的凈光合速率和吲哚乙酸氧化酶活性最高；D18p和Ubi1的葉片生長素含量和脫落酸含量都高于日本晴。[結(jié)論]OsmiR156過表達(dá)會引起植株矮化，分蘗數(shù)增多，3種材料的分蘗數(shù)與其葉片生長素含量及吲哚乙酸氧化酶活性呈線性正相關(guān)。

關(guān)鍵詞 水稻；OsmiR156；分蘗期；生理特性

Abstract [Objective] Through compare biochemical characteristics of OsmiR156 constitutive overexpression rice material D18p， OsmiR156 stem specificity expression rice material Ubi1 and their parent Nipponbare in physiological at tillering stage， this will provide reference basis for genetic improvement of yield traits in rice. [Method] Random soil pot experiment was set up， and rice biological characteristics of tillering stage were determined. [Result] The tiller number and plant height of three materials are no significant difference at early tillering stage. Tiller number of D18p or Ubi1 is higher than Nipponbare， but plant height of D18p or Ubi1 is lower than Nipponbare at mid and late tillering stage. The Ubi1 leaf net light photosynthetic rate and leaf indole acetic acid oxidase activity are the highest among the

three materials. The leaf auxin content and abscisic acid content in D18p and Ubi1 are higher than those in Nipponbare. [Conclusion] OsmiR156 overexpression result in plants dwarfed and tillering number

increased in rice. There is positive linear relationship between the tiller number and leaf auxin content in 3 materials， and there is too positive linear relationship between tiller number and IAA oxidase activity.

Key words Oryza sativa L.； OsmiR156； Tillering stage； Physiological character

水稻（Oryza sativa L.）作為模式作物有著很豐富和深入的基因組研究基礎(chǔ)，水稻產(chǎn)量性狀的遺傳改良取決于穗型、粒型、分蘗數(shù)和株型等一系列因素[1]。而分蘗直接影響農(nóng)作物穗數(shù)的多少，進而影響其單位產(chǎn)量[2]。國際水稻研究所的“超高產(chǎn)新株型”、“中國超級稻”和“超級雜交稻”的核心內(nèi)容都涵蓋了水稻的分蘗[3]。miRNA在植物生長發(fā)育過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，由于大多數(shù)保守的miRNA的靶基因mRNA編碼轉(zhuǎn)錄因子或者對細(xì)胞分化決定至關(guān)重要的生長調(diào)節(jié)因子[4]，當(dāng)這些miRNA過量表達(dá)或擾亂miRNA與靶基因的互補時可使生物體的表型發(fā)生明顯改變[5]。miR156是植物中一個非常保守的miRNA基因家族[6]，其靶基因SP是植物特有轉(zhuǎn)錄因子的典型代表[7]，改變miR156家族基因或靶基因含量，不僅引起植物幼年期、成熟期和花期的改變，還影響水稻分蘗。2006年熊立仲等報道了水稻過表達(dá)OsmiR156b和OsmiR156h導(dǎo)致植株變矮，分蘗增多[8]。李家洋等報道了OsmiR156的靶標(biāo)基因OsSPL14具有減少分蘗，增加小穗數(shù)和穗長的功能[9]。筆者采用水稻品種日本晴、轉(zhuǎn)基因材料Ubi1和轉(zhuǎn)基因材料D18p為試驗材料，系統(tǒng)地比較他們在分蘗期的生物學(xué)特性，以期為水稻產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試水稻（Oryza sativa L.） ，為日本晴（Nipponbare）、D18p和Ubi1。日本晴是轉(zhuǎn)基因材料D18p和Ubi1的受體，材料D18p是啟動子D18p啟動miR156在日本睛中的莖稈特異性過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料，材料Ubi1是啟動子Ubi1啟動 miR156在日本睛中的組成型過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料；供試材料，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室提供。

1.2 試驗設(shè)計與材料培養(yǎng) 土壤盆栽試驗在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室網(wǎng)室進行，采用隨機組合設(shè)計，土壤選用常年種植水稻的稻田土，供試土壤pH 5.12，有機質(zhì)含量為47.8 g/kg，全氮2.00 g/kg，堿解氮203.7 mg/kg，速效磷22.5 mg/kg，速效鉀242.9 mg/kg。圓柱形瓷盆大小為直徑×高度=40 cm×35 cm。在2013年3月26日對水稻試驗材料催芽育苗，于4月25日對秧苗進行移栽。共種植24盆，每種材料8盆，每盆插秧4株，水肥栽培措施等參照大田栽培。在水稻分蘗期的前期（5月22日）、中期（日本晴6月17日；D18p6月19日；Ubi16月21日）、后期（日本晴7月5日；D18p月3日；Ubi17月23日）3個時期進行生物學(xué)性狀的測定。

1.3 生物學(xué)性狀測定方法

1.3.1 株高、葉長和葉寬測定。用普通的精度為毫米的米尺進行測定。

1.3.2 光合作用的測定[10]。依王惠群等的方法稍作修改。在水稻分蘗后期的睛朗天氣的上午 10：00～12：00采用Li6400便攜式光合作用系統(tǒng)進行光合作用參數(shù)凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率的測定，測定環(huán)境條件為開放式氣路、紅藍(lán)光源、光通量密度為1 000 μmol/m2·s、相對濕度1 800 Pa和溫度20 ℃。選取生長一致的6盆中的6株的頂下第 2完全展開葉進行測定。

1.3.3 吲哚乙酸氧化酶活性的測定。依王小玲等[11]的方法稍作修改，用比色法測定單位時間內(nèi)吲哚乙酸的消失量，以每毫升酶液每小時內(nèi)破壞IAA的微克數(shù)表示酶活力的大小。

1.3.4 植物激素含量的測定。依Wang HQ等的方法測定[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 Excel 2003和SPSS17.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsmiR156過表達(dá)對分蘗期分蘗數(shù)、株高、葉長和葉寬的影響 由表1可知，日本晴、D18p和Ubi1 3種試驗材料在分蘗的初期、中期和后期的分蘗數(shù)、株高、葉長和葉寬4個生物學(xué)性狀指標(biāo)都呈上升的趨勢。在水稻分蘗的初期，3種材料的分蘗數(shù)、株高、葉長和葉寬4個指標(biāo)沒有顯著性差異（P>0.05）。在分蘗的中期和后期，D18p 和Ubi1的分蘗個數(shù)都高于日本晴，而株高、葉長和葉寬都低于日本晴。由此可知，OsmiR156在水稻分蘗初期，對于水稻的分蘗數(shù)、株高、葉長和葉寬的影響沒有顯著性差異（P>0.05），而到水稻分蘗的中期和后期，則具有顯著性差異（P<0.05）。

2.2 OsmiR156對水稻分蘗后期光合作用參數(shù)的影響 OsmiR156對水稻分蘗后期的光合作用參數(shù)都有著不同程度的影響（表2）。在水稻分蘗后期，3種材料的凈光合速率沒有顯著差異（P>0.05）。而3種材料的氣孔導(dǎo)度都有顯著性差異（P<0.05）。Ubil的氣孔導(dǎo)度最大，分別比日本晴和D18p的氣孔導(dǎo)度高出81.5%和104.8%。3種材料的胞間CO2濃度也具有顯著性差異（P<0.05）。Ubil的胞間CO2濃度分別高出日本晴與D18p胞間CO2濃度16.1%和20.8%。日本晴的蒸騰速率最高，D18p與Ubil的蒸騰速率較為接近，其中日本晴的蒸騰速率分別比D18p和Ubil的蒸騰速率高出23.6%和24.3%。

3 結(jié)論與討論

呂明芳研究表明，當(dāng)OsmiR156過量表達(dá)時，會使植物出現(xiàn)植株明顯矮化，分蘗增加，開花延遲結(jié)實率極低或不結(jié)實等表型[13]。OsmiR156的過表達(dá)對水稻的分蘗數(shù)、株高、葉長和葉寬都有明顯影響。試驗結(jié)果表明，Ubi1的分蘗數(shù)明顯高于日本晴和D18p，而株高、葉長和葉寬則明顯低于日本晴和D18p，這與呂明芳的結(jié)果一致。由此可知，OsmiR156的組成型過表達(dá)對于水稻的分蘗是有明顯促進作用，而對于莖和葉片的生長則起抑制作用。由日本晴與D18p、Ubi1的比較可以得出，OsmiR156的莖稈過表達(dá)對于水稻的分蘗數(shù)以及葉片和莖的生長影響不明顯。

水稻分蘗期隨著分蘗的進行，光合作用的各項指標(biāo)也會發(fā)生相應(yīng)改變。在詹可等的研究中提出過水稻的成穗率越高，水稻的光合作用率也會相應(yīng)提高的結(jié)論[14]。蔣彭炎等得出水稻成穗率與光合作用效率成正比的結(jié)果，而水稻的無效分蘗則會降低光合作用效率[15]。miR156是調(diào)控水稻分蘗的關(guān)鍵miRNA之一。其表達(dá)不僅僅影響水稻分蘗過程中的各種性狀，同時也影響水稻分蘗后期各項光合作用參數(shù)。試驗3種材料的結(jié)果顯示，由于在凈光合速率方面，對照組與2種突變體沒有明顯差異，可以推斷miR156的表達(dá)對水稻分蘗后期植物的光合速率沒有明顯影響。氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度方面由于三者數(shù)值相差明顯，可以看出OsmiR156過表達(dá)表達(dá)影響氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度的變化。其中OsmiR156組成型過表達(dá)的Ubil突變體氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度都是最高。miR156也影響蒸騰速率的變化，Ubil突變體的蒸騰速率相對較低。Ubil突變體的分蘗數(shù)多于D18p與日本晴，在光合作用指標(biāo)方面氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度的增加是因為分蘗數(shù)的增加影響單個葉片的光合作用效率，為了保證光合作用的有效進行，植物采取了增加底物濃度的方式。而OsmiR156過表達(dá)引起的葉面積的減小則導(dǎo)致了Ubil的蒸騰作用小于D18p和日本晴。

分蘗是水稻生長發(fā)育過程中形成的一種特殊分枝是影響水稻產(chǎn)量的主要因素之一，分蘗芽的形成受到植物激素、環(huán)境及遺傳因子的調(diào)控，其中植物激素在分蘗的發(fā)生和衰亡過程中起著至關(guān)重要的作用[16]。研究OsmiR156對水稻分蘗后期分蘗數(shù)與生長素含量、吲哚乙酸氧化酶活性的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，OsmiR156過表達(dá)引起的分蘗數(shù)變化與葉片中的生長素含量成正相關(guān)，生長素對分蘗芽的抑制存在頂端優(yōu)勢現(xiàn)象，即其由莖頂端自上而下向基部的極性運輸（polar auxin transport，PAT）抑制分蘗芽的生長。例如，高度分蘗的水稻若去掉穎花將促進分蘗伸長，加入IAA則起抑制作用細(xì)胞分裂素在根中合成，植物失去頂端優(yōu)勢后，在莖中也有合成，受外源生長素抑制其與生長素在水稻體內(nèi)形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控水稻分蘗[17-18]。

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