尹燕博

自從1994年在我國首次分離到H9N2亞型禽流感病毒以來，該病已經(jīng)在我國廣泛流行，可以說我國凡是有雞的地方，就有H9N2亞型禽流感流行。除此之外，又有不斷從豬、鴕鳥、鴨、鵝等動物分離到H9N2病毒的報道。

更值得關注的是，H5N2、H7N9等病毒致病力及動物嗜性的變化均與H9N2有關：2013年11月農(nóng)業(yè)部通報的河北H5N2流行毒株，為7.2群的H5N1流行毒株與H9N2流行毒株的基因重排毒株，其HA和M基因來源于7.2群H5N1，NA及其他內(nèi)部基因來源于H9N2流行株；H7N9的6個內(nèi)部基因片段與上海、浙江、江蘇等地雞群流行的H9N2相似，非結(jié)構(gòu)蛋白基因（NS）可能來源于江蘇周邊雞群，而其他5個片段來源于上海、浙江附近雞群，且H7N9不斷與H9N2內(nèi)部基因發(fā)生重排，并在不斷感染人。由此可見H9N2病毒在持續(xù)推動著高致病流感病毒的變異。

H9N2禽流感在我國的流行，以2007年為界，可分為兩個階段：在此之前，臨床癥狀主要以呼吸道癥狀為主，激發(fā)大腸桿菌病，產(chǎn)蛋雞引起生殖系統(tǒng)病變并導致產(chǎn)蛋下降，少有毒株致死雞胚并在實驗室條件下復制出典型的臨床病變；在此之后的流行株，除能引起呼吸道和生殖系統(tǒng)典型病變外，還可引起典型的腎臟腫大、出血、尿酸鹽沉積等泌尿系統(tǒng)病變，不僅能致死雞胚的毒株所占的比例越來越大，而且在實驗室攻毒試驗中可復制出典型發(fā)病，并致死SPF雞。上述情況表明，H9N2禽流感臨床分離株的致病力有不斷增強的趨勢。

從臨床實踐看，H9N2亞型禽流感已經(jīng)成為養(yǎng)雞業(yè)、特別是肉雞養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病，其造成的損失緊隨高致病流感之后，已遠遠超過新城疫、傳染性支氣管炎等疾病。針對這種情況，我們從以下幾個方面開展了較為系統(tǒng)的研究：

1 臨床發(fā)病情況調(diào)查

我們在2008年1月～2012年6月期間，對不同地區(qū)送檢的5001份病料中有2425份可檢出NDV、IBV和AIV（H9）中的一種或多種，陽性率高達48.49%；其中NDV陽性率為13.10%，IBV陽性率為9.24%，AIV（H9）陽性率為26.15%，說明該段時間NDV、IBV和AIV（H9）3種病毒在北方主要養(yǎng)雞地區(qū)中普遍存在，且以AIV（H9）感染最為嚴重，見圖1。

H9N2禽流感屬條件致病性病原，對氣溫和空氣濕度變化特別敏感。當雞舍過度通風，溫度不穩(wěn)定、特別是突然降低，空氣相對濕度低于40%時，H9N2易出現(xiàn)典型發(fā)病，但其臨床表現(xiàn)會因毒株致病特點及環(huán)境條件的不同存在明顯差異。有的以呼吸系統(tǒng)病變?yōu)橹?，有的則主要表現(xiàn)為腎腫、腎出血?？偟恼f來主要表現(xiàn)鼻腔、氣管和支氣管粘膜環(huán)狀出血，十二指腸和泄殖腔粘膜出血，盲腸扁桃體腫大、出血。

干冷氣候條件下，很多病例出現(xiàn)纖維蛋白滲出形成的支氣管堵塞，而且空氣濕度越低，堵塞的位置越趨向支氣管下端，這種情況極易出現(xiàn)大批死亡。

胰腺通常表現(xiàn)邊沿部出血，但有的病例也出現(xiàn)高致禽病流感才有的斑點狀或片狀、半透明、液化性壞死。

發(fā)病雞肺臟常出現(xiàn)水腫、淤血，色彩斑駁或紫黑色。很多病例在H9N2基礎上激發(fā)大腸桿菌病，出現(xiàn)纖維素性氣囊炎、心包炎、肝包膜炎和腹膜炎。如果家禽臨床上廣泛出現(xiàn)典型且難治愈的大腸桿菌病病變，則其背后肯定有一個病毒性因素在起作用，而H9N2則是最常出現(xiàn)的病毒性因素。

2 H9N2亞型禽流感病毒分離株對雞胚及雞的致病力研究

2.1 2007年以來H9N2臨床分離株不同雞胚死亡時間的毒株所占比例統(tǒng)計分析 為了研究H9N2亞型禽流感病毒，本實驗室持續(xù)采集臨床樣本分離病毒，從2006～2013年春季，共采集近6千份臨床樣本，經(jīng)分離鑒定出750余株H9N2亞型禽流感病毒，涉及我國華東、華北，東北和西北的大部分重點肉仔雞養(yǎng)殖地區(qū)。

通過表1、圖4分析發(fā)現(xiàn)：2007年以來，臨床上分離到的H9N2亞型禽流感病毒，能致死雞胚的毒株所占的比例在2007年之后逐年大幅增加，到2012年達到高峰，但在2013年又明顯降低，到今年8月底雖有小幅增加，但也明顯低于2012年。

2.2 兩株H9N2亞型禽流感病毒對SPF雞致病力研究 隨機選取5周齡SPF白來航雞45只，平均分為三組，每組15只雞。兩組作為攻毒組，一組作為對照組。將A/CK/SD827/09和A/CK/LN103/10兩株H9N2亞型禽流感病毒尿囊液原液無菌過濾后，每只雞靜脈注射0.2ml病毒原液。在攻毒12h后，CK/SD827/09和CK/LN103/10攻毒組分別死亡10只和9只。剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟周圍充滿滲出液，肺臟充血、水腫，盲腸扁桃體充血、出血、腫脹，腎臟充血腫脹，肝臟有出血點。沒有死亡的雞出現(xiàn)張口呼吸、閉眼、縮頭、呆立等癥狀，這些癥狀在攻毒后第4天基本消失，直至攻毒后第10天實驗結(jié)束時再無其他雞死亡。

2.3 按照OIE規(guī)定新城疫毒力標準評價部分H9N2分離株的致病力 將6周齡SPF白來航雞隨機分成10組，每組20只，其中9組雞作為攻毒組，每組雞對應一株毒，剩余一組作為對照組。將H9N2亞型禽流感毒株用PBS稀釋10倍后，每只雞翅靜脈注射0.1ml。

研究結(jié)果表明，2008年以來流行的H9N2亞型禽流感毒株以毒力較強的毒株為主，H9N2亞型禽流感在攻毒3～5d后，在體內(nèi)復制達到高峰，這時期排毒量較大。致病性較強的H9N2亞型禽流感病毒在SPF雞體內(nèi)有較強的復制能力，并引起發(fā)病雞比較嚴重的組織病理學變化。致病力較強的毒株能在腎臟中有效的復制，與目前臨床發(fā)現(xiàn)H9N2亞型禽流感引起的腎臟病變相一致，H9N2病毒感染造成的病理變化見表2。

H9N2亞型禽流感病毒的變異速度越來越快，不斷出現(xiàn)HA基因差異較大的變異毒株，進化樹上幾乎每年都有新的亞群出現(xiàn)，見圖5。同一時間、同一地點，有不同分支的病毒在流行。HA基因的變異可能會引起病毒抗原性的改變。從分離到的H9N2亞型禽流感毒株中，我們從進化樹的每個分支中挑選一個能夠體現(xiàn)該分支毒株與其他分支毒株間氨基酸序列的規(guī)律性變化的，且HA蛋白氨基酸序列存在顯著差異的12株代表性分離株（用紅色下劃線標出），分別制備單因子血清，進行交叉血凝抑制（HI）及雞胚中和試驗，并計算出他們之間的抗原相關系數(shù)。H9N2 HA蛋白氨基酸差異與病毒抗原性差異的相關性研究毒株選擇情況進化樹見圖6。

HA蛋白氨基酸差異與病毒抗原性差異基本上呈正相關，當病毒間的HA蛋白氨基酸序列差異在3.6%以內(nèi)時，病毒的抗原性無明顯差異；當病毒間的HA蛋白氨基酸序列差異在3.6%～7.0%之間時，病毒之間的抗原性可能存在差異，此區(qū)域?qū)儆谝粋€過渡性區(qū)域；當病毒間的HA蛋白氨基酸序列差異大于7.0%時，毒株間均存在較大抗原性差異。

這提示在H9亞型禽流感病毒的免疫工作要注意流感病毒的變異，可對H9亞型禽流感病毒HA蛋白氨基酸序列的差異性進行測定，估算抗原性的改變，針對性地選擇疫苗毒株生產(chǎn)疫苗進行免疫。

此試驗結(jié)論的得出是經(jīng)HA蛋白氨基酸差異與病毒抗原性差異試驗數(shù)據(jù)的不完全歸納，不排除例外的情況出現(xiàn)。

4 目前H9N2禽流感免疫中存在的問題

4.1 毒株問題 有些雞場同時流行不同的毒株，單價疫苗免疫效果有時存在漏洞。

4.2 免疫程序問題 主張大日齡（10～15日齡）免疫，但要根據(jù)具體情況定；兩次免疫比一次免疫效果好（1日齡和15日齡）。

4.3 母源免疫問題 種雞的免疫要跟著商品雞走，商品雞流行什么樣的病，種雞就免疫什么樣的疫苗。用母源免疫把商品雞的發(fā)病日齡推到20日齡之后，商品雞的防疫就主動多了。

4.4 飼養(yǎng)管理問題 H9N2亞型禽流感病毒，在大多數(shù)情況下屬條件致病性病原，所有使雞群抵抗力下降的因素，都會放大H9N2所造成的損失！