李新等

摘 要 以山蔞單芽莖段為外植體，對其進行組織培養(yǎng)和快速繁殖研究。結果表明：山蔞嫩莖最佳消毒方法為70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒9 min；適合腋芽萌發(fā)的啟動培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；繼代增殖培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；試管苗在1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根較好；山蔞試管苗移栽成活率可以達到95%以上。

關鍵詞 山蔞；組織培養(yǎng)；快速繁殖；表面消毒

中圖分類號 TS971 文獻標識碼 A

Abstract Tissue culture and rapid propagation of Piper sarmentosum were conducted with single-node stems as the explants. The results showed that the best surface sterilization was achieved by immersing the explants in the solution of 70% alcohol for 30 seconds then in 0.1% HgCl2 solution for 9 minutes. The medium（MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）was suitable for starting culture of P. sarmentosum. Successful shoot proliferation was obtained on MS supplemented with 0.1 mg/L NAA and 3 mg/L 6-BA. The optimal rooting medium was 1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA.

Key words Piper Sarmentosum； Tissue culture； Rapid propagation； Surface sterilization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.026

山蔞（P. sarmentosum Roxb.）別名有山撈、假蒟、假蔞等，為胡椒科胡椒屬植物。在中國海南、廣東、廣西、云南、福建等南部省區(qū)均有分布。山蔞葉面光亮有革質(zhì)，有一種特異的香味。在海南黎族地區(qū)，人們常常用它的葉子來做菜，極具地方風味特色，著名的菜品有“黎家綠葉寶”、“山蔞葉肉碎煎蛋角”、“山蔞葉煎蛋”、“假蔞煎肉夾”、“魚茶釀苦瓜”等，另外，山蔞葉還可用來爆炒、紅燒、干煸、煲煮各色肉品，使菜肴口味醇厚濃香，深受食客歡迎[1-4]。據(jù)測定，山蔞葉的維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸和礦質(zhì)元素營養(yǎng)含量豐富，尤其是山婁葉中鈣、鐵、鋅、錳和鍶的含量很高，屬于超鈣富鉀、富鋅超鐵蔬菜，除具有獨特的風味外，還具有良好的保健功能[5]。此外，山蔞具有一定的藥用價值，可以全株、根、葉或果實入藥。藥性辛，溫。溫中散寒，祛風利濕，消腫止痛。用于胃腸寒痛、風寒咳嗽、水腫、瘧疾、牙痛、腳氣、痔瘡、風濕性關節(jié)炎、疝氣痛、風濕骨痛、跌打損傷[2]。因此，不論是作為熱帶特色的香菜，還是作為藥用植物，其開發(fā)前景都十分廣闊。

山蔞繁殖可以用扦插、壓條、種子進行繁殖[6]，但常規(guī)繁殖方法使用的繁殖材料多，繁殖速度慢，不利于大規(guī)模推廣種植。而采用組織培養(yǎng)方法進行繁殖，使用起始繁殖材料少，繁殖速度快，而且可以在一定的空間內(nèi)實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，能在短期內(nèi)滿足大規(guī)模推廣種植需要[7-8]。目前，對山蔞的組織培養(yǎng)研究尚未見有關報道。因此，本文利用山蔞單芽莖段通過叢生芽途徑進行快繁，旨為山蔞的擴大種植和開發(fā)利用奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自海南大學（儋州校區(qū)）農(nóng)學院苗圃基地以及海南大學（儋州校區(qū)）園藝園林學院實驗基地。2012年7月取野外生長的山蔞進行室內(nèi)盆栽，待嫩莖長出后取材；另于2013年3～7月連續(xù)晴天數(shù)天時，上午取材，選取生長旺盛、無病蟲害的嫩莖。

1.2 方法

1.2.1 外植體的表面消毒與接種 將采集的山蔞嫩莖剪成長為3 cm左右的單芽莖段，清水浸泡10～20 min，然后轉移到洗衣粉水中浸泡15 min，再用流水沖洗30 min后，放入含有多菌靈的溶液中浸泡30 min，再用流水沖洗1 h，用吸水紙慮干備消毒處理。消毒時先用70%酒精浸泡單芽莖段30 s，然后在轉移到0.1%升汞溶液（滴有2～3滴吐溫）中處理3～12 min。將消毒處理后的外植體用無菌水沖洗4～5次，用滅菌濾紙濾干后放在超凈工作臺上備用。接種時，在超凈工作臺上將單芽莖段修剪成1 cm左右，插入滅菌培養(yǎng)基。每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，重復3次，于接種15 d后統(tǒng)計污染率、褐化率以及存活率，選擇最佳消毒方式。污染率/%=污染的外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù)×100；褐化率/%=未污染的褐變外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù)×100；存活率/%=存活的外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.2.2 初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)使用的啟動培養(yǎng)基為MS+0～0.5 mg/L NAA（1-naphthaleneacetic acid）+0～4 mg/L 6-BA（6-benzylaminopurine）。每個處理組合接種20瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復，30 d后統(tǒng)計萌芽率。萌芽率/%=產(chǎn)生芽的外植體數(shù)/總的接種外植體數(shù)×100。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)生長出來的腋芽接種于附加0～0.2 mg/L NAA、0～4 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復，20 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=繼代增殖培養(yǎng)1個周期后產(chǎn)生的芽數(shù)/增殖培養(yǎng)前轉接的芽數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將長至適當高度的苗芽接種于附加0～3 mg/L NAA、0～0.5 mg/L 6-BA的1/2 MS培養(yǎng)基上，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復，20 d后觀察生根狀況并統(tǒng)計生根率和平均生根長度。生根率/%=生根苗數(shù)/總的接種株數(shù)×100，平均根長（cm）=根總長/生根數(shù)。

1.2.5 培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基均附加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂粉，pH值滅菌前調(diào)至5.8；培養(yǎng)基在滅菌鍋里滅菌的溫度、時間分別為121 ℃、30 min；培養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在（25±1）℃，光照強度2 000～3 000 lx，光周期16 h/8 h（晝/夜）。

1.2.6 煉苗移栽 將生根發(fā)育良好的組培苗連同培養(yǎng)瓶移到室外遮陰棚中進行閉瓶煉苗10 d左右，然后將培養(yǎng)瓶的蓋子打開，在自然光下進行開瓶煉苗5 d左右。試管苗移栽時用鑷子小心取出，用無菌水沖洗根部附著的培養(yǎng)基成分，并用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗，把生根苗移栽到黏土：河沙（1 ∶ 1）基質(zhì)中，然后進行常規(guī)管理。

1.3 統(tǒng)計處理

實驗中所獲得的各處理數(shù)據(jù)均先用反正弦函數(shù)代換，再進行方差分析，在p<0.05水平上，用Duncan法做多重比較[9-10]。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒

直接從野外采集外植體進行消毒，無論如何處理，污染率極高，幾乎得不到無菌材料。采用室內(nèi)盆栽植株的外植體進行消毒處理的結果見表1。未進行消毒處理的對照組，接種材料全部污染，褐化率和成活率均為0。隨著消毒時間的增加，污染率由升汞消毒3 min的100%逐漸降低，到消毒12 min時只有8.3%；而褐化率在處理3～6 min時均為0，之后逐漸升高，消毒12 min時達到73.3%；而成活率也隨消毒時間的增加而提高，在處理8（升汞消毒9 min）達到最高，顯著高于其他處理，之后隨著消毒時間的增加，成活率呈下降趨勢。

2.2 初代培養(yǎng)

由表2可知，在相同NAA濃度的不同組處理中，萌芽率大體上隨6-BA濃度的增加而增加。處理14，即MS培養(yǎng)基添加0.5 mg/L NAA和3 mg/L 6-BA處理所得的萌芽率最高，達到78.3%，顯著高于其他處理。當6-BA濃度為0，NAA濃度為0.25 mg/L及0.5 mg/L時，處理所得萌芽率次低和最低，分別達11.7%和10%，顯著低于其他處理。

2.3 繼代培養(yǎng)

如同在初代培養(yǎng)中的情況，在相同NAA濃度的不同組處理中，繼代增殖率隨6-BA濃度的增加而增加。由表3可知，處理10（MS+0.1 mg/L NAA+4 mg/L 6-BA）的增殖系數(shù)為3.3，顯著高于除處理9（MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA）外的其它處理。在NAA濃度為0.1 mg/L或0.2 mg/L但不附加6-BA的情況下，可能由于生長素NAA對增殖的抑制作用，未見增殖芽產(chǎn)生；而6-BA濃度達到4 mg/L時，基部產(chǎn)生的愈傷組織較嚴重，產(chǎn)生的苗也較弱（結果未顯示）。綜合來看，處理9的增殖效果較好。

2.5 生根培養(yǎng)

由表4可知，山蔞苗芽生根率在各NAA和6-BA濃度組合中隨生長素NAA濃度的增加而增加，而且附加一定量的6-BA更有利于生根。處理15（1/2MS+3 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA）、14（1/2MS+3 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA）和處理16（1/2MS+3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA）的生根率分別為95%、83.3%和81.7%。統(tǒng)計分析結果表明，這3個處理差異不顯著，但與其他處理的差異均達到顯著。處理14的根長最長，除了與處理10、處理15以及處理16之間的差異不顯著外，與其余各組處理之間的差異均顯著。但各處理的生根數(shù)都只有1～2條。

煉苗移栽結果表明，山蔞試管苗移栽成活率可以達到95%以上。

3 討論與結論

外植體的消毒處理是決定組織培養(yǎng)能否成功的關鍵因素之一。由于山蔞野生于高溫陰濕的橡膠林下，從野生環(huán)境中采集的外植體不可避免地攜帶大量的外生菌和內(nèi)生菌，內(nèi)部污染是極難進行表面消毒的。本試驗從野生環(huán)境中取材表面消毒幾乎無法成功，這與同屬的栽培胡椒組織培養(yǎng)中外植體的污染問題類似[11]。只有將野生植株移栽到潔凈環(huán)境采集新長出的外植體，才獲得成功。0.1%升汞溶液是一種強效滅菌劑，雖然隨著消毒時間的延長，污染率會降低，但在殺滅外植體菌種的同時，亦可能對外植體本身產(chǎn)生傷害，導致外植體接種后出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，并在某個處理時間之后降低成活率。這也是本試驗中0.1%升汞消毒10 min以上處理反而使褐化率和成活率降低的原因。

利用山蔞單芽莖段進行啟動和增殖培養(yǎng)中，6-BA發(fā)揮極其重要的作用，在相同NAA濃度的不同組處理中，萌芽率和增殖率大體上隨6-BA濃度的增加而增加；在附加生長素NAA而不附加6-BA的情況下，增殖系數(shù)均為0。同時觀察到，6-BA與NAA組合要比單獨使用6-BA對啟動和增殖培養(yǎng)的效果好。這與同屬植物栽培胡椒的組織培養(yǎng)情況類似[12-13]。

由于胡椒屬植物難以表面消毒（尤其是內(nèi)源性污染）和容易褐化，胡椒屬中不同物種的組織培養(yǎng)的難易程度具有物種和基因型的依賴性，因此，胡椒屬植物仍然是目前較難組織培養(yǎng)的植物之一。在胡椒屬植物莖尖和莖段培養(yǎng)方面，除劉進平等[12-13]對大葉種胡椒進行組織培養(yǎng)外，Mathew等[14]對胡椒的一個雜種Panniyr 1的無菌萌發(fā)實生苗莖尖進行了培養(yǎng)，在MS+1 mg/L IAA（3-indolylacetic acid）+1 mg/L 6-BA上實現(xiàn)叢生芽增殖；Philip等[15]對6年生的胡椒品種Panniyur-1、Karimunda和Arivalli大田苗的莖尖進行培養(yǎng)，在附加或不附加160 mg/L AdSO4的MS+1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上可增殖成芽。而Bhat等[16]在對胡椒屬的3個種胡椒（P. nigrum）、P. betel和P. longum的根、葉、節(jié)和節(jié)間外植體的形態(tài)發(fā)生潛力進行了比較，發(fā)現(xiàn)P. colubrinum的反應最好，其次為P. betel和胡椒（P. nigrum），并且發(fā)現(xiàn)6-BA對芽的誘導優(yōu)于KT（kinetin）。本文對胡椒屬植物山蔞（P. sarmentosum）組織培養(yǎng)進行研究，利用室內(nèi)萌芽抽條作外植體，有效克服了不能獲得無菌培養(yǎng)的困難，同時，6-BA與NAA組合可實現(xiàn)叢生芽增殖。

本試驗結果表明，山蔞幼嫩莖段最佳消毒方法為70%酒精消毒30 s后再用0.1%升汞溶液消毒9 min；啟動培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA為宜；繼代增殖培養(yǎng)最適宜的培養(yǎng)基為MS+ 0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA；生根培養(yǎng)基采用1/2MS+3 mg/L NAA+0.1-0.5 mg/L 6-BA生根效果較好。利用本試驗結果可成功地對山蔞進行組織培養(yǎng)和快速繁殖，這將為山蔞大規(guī)模推廣種植打下種苗工廠化生產(chǎn)的技術基礎。

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