王文濤等

摘要

用干冰和液氮作為凍源對(duì)民豬精液冷凍效果進(jìn)行研究，包括對(duì)精子活率及頂體完整率的影響。結(jié)果表明，以干冰為凍源進(jìn)行民豬精液冷凍，解凍后精子活率為43.5%，頂體完整率為52.2%；以液氮為凍源進(jìn)行民豬精液冷凍，解凍后精子活率為41.8%，頂體完整率為51.5%，二者差異不顯著。

關(guān)鍵詞 民豬；冷凍精液；保存效果

中圖分類號(hào) S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）11-03280-02

Abstract The cryoprotective effects of dry ice and liquid nitrogen on frozenthawed semen in the Min pig were studied， including sperm motility and acrosome integrity. The result showed that the sperm motility is 43.5% and the sperm acrosome integrity is 52.2% by dry ice； the sperm motility is 41.8% and the sperm acrosome integrity is 51.5% by liquid nitrogen. There have no significant differences between the dry ice and liquid nitrogen.

Key words Min pig； Frozen semen； Preservation effect

目前，豬人工授精技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，所用精液大多為新鮮精液，用鮮精配種存在成本高、浪費(fèi)嚴(yán)重和易交叉感染等問題，這使人們的視線逐漸轉(zhuǎn)移到冷凍精液上。豬精子本身對(duì)冷應(yīng)激特別敏感，在冷凍過程中極易損傷，從而造成母豬的受胎率低、窩產(chǎn)仔數(shù)少，嚴(yán)重制約著豬冷凍精液的應(yīng)用。因此，深入系統(tǒng)研究豬精液冷凍機(jī)理和生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)，探討影響豬凍精活率及受精能力的因素，進(jìn)一步提高受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，已成為國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬生產(chǎn)中亟需解決的問題[1]。

民豬作為我國(guó)優(yōu)良的地方豬種，其高繁殖力、高肉質(zhì)品質(zhì)受到消費(fèi)者的廣泛關(guān)注，民豬冷凍精液技術(shù)的研究將極大提高民豬種豬利用率、保存率，對(duì)民豬保種工作的開展和民豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重要的意義。筆者以液氮和干冰作為民豬精液冷凍過程中的凍源，對(duì)其活率及頂體完整率等指標(biāo)進(jìn)行研究，旨在為選擇適合民豬精液冷凍的凍源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。民豬種公豬選自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖繁育基地。

1.1.2

試劑。液氮；干冰；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

精液稀釋液（冷凍基礎(chǔ)液）：碳酸氫鈉0.1 g，葡萄糖2.75 g，EDTA 0.29 g，檸檬酸三鈉0.69 g，Tris 0.56 g，加水至100 ml混合均勻。

冷凍保護(hù)液Ⅰ液：將11%的乳糖液與新鮮蛋黃以4∶1的比例混合，攪拌均勻，冷卻至17 ℃，備用。

解凍液（BTS）：檸檬酸鈉0.6 g，葡萄糖3.7 g，EDTANa2 125 mg，碳酸氫鈉125 mg，氯化鉀75 mg，加水至100 ml混合均勻，使用時(shí)另添加10%新鮮蛋黃混合攪拌均勻。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

民豬精液的采集。民豬精液采集采用手握法采精，需要注意的是民豬被毛濃密，采精過程中被毛、皮屑對(duì)精液的污染較為嚴(yán)重，在采精前應(yīng)對(duì)公豬進(jìn)行刷拭和剪毛，以防止精液污染[2]。精液采集后，以精液稀釋液與原精1∶1的比例混合，鏡檢精子活力，選取活力70%以上的精子進(jìn)行冷凍操作。

1.2.2

民豬精液的冷凍。鏡檢合格的精液置于17 ℃下平衡1 h后分裝于10 ml離心管中，置于控溫至17 ℃的離心機(jī)中800 r/min離心10 min，去除上清，鏡檢密度達(dá)到109，備用；在合格精液中，以1∶1的比例添加冷凍保護(hù)液Ⅰ液，4 ℃下平衡1 h，鏡檢，將活力大于70%的精液裝入0.25 ml冷凍細(xì)管，PVA封口粉封口[3]，備用。采用不同凍源進(jìn)行冷凍。

①干冰冷凍方法：利用干冰為冷源進(jìn)行精液冷凍。將裝有精液的冷凍細(xì)管置于干冰平面，約5min后將冷凍細(xì)管放入紗布袋，最后投入到液氮中進(jìn)行冷凍保存；②

液氮冷凍方法：利用液氮為冷源進(jìn)行精液冷凍。將裝有精液的冷凍細(xì)管懸于距液氮面5 cm 處，液氮熏蒸5 min，最后放入紗布袋投入到液氮中進(jìn)行冷凍保存。

1.2.3

民豬精液的解凍。采用濕解法解凍，以BTS液為解凍液。42 ℃水浴，解凍后1 000 g離心5 min，重復(fù)2次。用DPBS重新懸浮，鏡檢。

1.2.4

民豬精液的品質(zhì)檢測(cè)。

1.2.4.1

精子活率。將解凍后精液以DPBS20倍稀釋后，37 ℃下靜置20 min，混勻，在顯微鏡400倍下取20 μl于37 ℃恒溫加熱臺(tái)上，用血球計(jì)數(shù)板法按照以下公式計(jì)算精子活率：精子活率=（直線運(yùn)動(dòng)精子/精子總數(shù)）×100%。

1.2.4.2

頂體完整率。采用考馬斯亮藍(lán)G250進(jìn)行解凍精液頂體完整率檢測(cè)，頂體完整的精子可以被染色為藍(lán)色，頂體破損的精子不能被染色。

精子頂體完整率=（頂體完整精子/精子總數(shù)）×100%

3 討論

豬精液冷凍技術(shù)大多采用干冰、液氮等作為凍源，將精液特殊處理后冷凍，然后投入超低溫液氮中，使精子細(xì)胞的代謝完全停止，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的[4]，精子的損傷程度最終由降溫速率和冷凍的最終溫度來決定[5]。筆者分別采用干冰冷凍方法和液氮冷凍方法對(duì)民豬精液進(jìn)行冷凍研究，在解凍后民豬精液活率、頂體完整率方面，采用干冰作為凍源效果優(yōu)于液氮，但二者差異并不顯著，可能是由于液氮的蒸發(fā)速度較快，使冷凍過程中溫度變化幅度較大，造成精子的損傷程度高于干冰作為凍源的精子，具體原因仍需進(jìn)一步試驗(yàn)來驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]

高飛，岳奎忠，楊增明.豬精液液態(tài)保存的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧雜志，2004，4（6）：46-49.

[2] 王文濤，何鑫淼，彭福剛，等.中型民豬種公豬選擇及采精技術(shù)要點(diǎn)[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（8）：164.

[3] 馬紅，王文濤，劉娣.民豬精液冷凍技術(shù)研究[J].豬業(yè)科學(xué)，2013（7）：124-125.

[4] 禚艷書，王堅(jiān)，劉鐵錚.豬精液冷凍保存研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（3）：136-140.

[5] YI Y J，IMD G S，PARK C S.Lactoseegg yolk diluent supplemented with Nacetyldglucosamine affect acrosome morphology and motility of frozenthawed boar sperm[J].Animal Reproduction Science，2002，74（3/4）：187-194.