石曉燕等

摘要 [目的]初步建立了涂層毛細管膠束電動色譜快速測定三聚氰胺含量的簡便方法。[方法]以40 mmol/L磷酸二氫鈉和20 mmol/L十二烷基硫酸鈉（SDS）為分離緩沖溶液，以石英毛細管為分離柱，于234 nm波長處檢測，采用峰高外標(biāo)法定量。通過對分離緩沖液的組分、石英毛細管涂層、pH及電壓對三聚氰胺分析的影響進行研究。[結(jié)果]該方法檢出限0.48 mg/L，線性范圍為10～500 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)0.998 5，三聚氰胺出峰時間小于0.8 min。[結(jié)論]通過改進樣品處理和試驗操作方法，提高回收率，可望滿足乳制品中三聚氰胺的定性、定量測定。

關(guān)鍵詞 膠束電動色譜；涂層毛細管；三聚氰胺；三甲基氯硅烷

中圖分類號 S121 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03374-02

Abstract [Objective] A preliminary， simple， and rapid micellar electrokinetic chromatography （MEKC） method was established for determination of melamine using coated capillary. [Method] The chromatographic separation was carried out in a coated capillary with a separation buffer composed of 40 mmol/L disodium hydrogen phosphate and 20 mmol/L sodium dodecyl sulfate （SDS）. Melamine was detected at 234 nm and quantified by peakheight external standard method. The effects of components of buffer， trimethylchlorosilane coating， pH and applied voltage were investigated. [Result] The detection limits of the method were 0.48 mg/L. The linear range was from 10 to 500 mg/L with a correlation coefficient of 0.998 5. Melamine peak appeared less than 0.8 min. [Conclusion] Through perfecting sample treatment and experiment operation method， the recovery rate was improved， which can satisfy the qualitative and quantitative determination of melamine in dairy products.

Key words Micellar electrokinetic chromatography； Coated capillary； Melamine； Trimethylchlorosilane

2008年9月爆發(fā)了三鹿嬰幼兒奶粉事件，其非法添加物為高含氮量的三聚氰胺。此后，三聚氰胺的分析測定方法研究受到了廣泛的關(guān)注[1]。用于測定食品中三聚氰胺含量的先進方法主要有高效液相色譜法[2-3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、親水作用色譜[6]、毛細管電泳法[7-8]和低溫等離子體探針串聯(lián)質(zhì)譜法[9]。膠束電動毛細管色譜（MEKC）是色譜和電泳原理的結(jié)合性電泳技術(shù)，也是毛細管電泳中發(fā)展較快且應(yīng)用廣泛的技術(shù)，能同時分離中性分子和帶電離子，它彌補了毛細管區(qū)帶電泳無法分離中性粒子的缺陷。因此最初主要用于不帶電物質(zhì)的分離，近年來應(yīng)用范圍逐漸擴大，只要分析物在電荷大小形態(tài)稍有差別，即可以得到有效的分離[10-11]。依據(jù)有機硅羥基保護劑原理，三甲基氯硅烷可以容易地與毛細管內(nèi)壁結(jié)合，當(dāng)分離緩沖溶液通過后，其SDS的疏水基團就會與三甲基硅基通過疏水相互作用結(jié)合，從而形成雙涂層，增大了電滲流，縮短了分離時間，提高了分離效率[12]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ毛細管電泳儀（帶二極管陣列檢測器），美國Beckman公司；PHS3C型酸度計，上海大普儀器有限公司。三聚氰胺，分析純，天津市巴斯夫化工試劑有限公司；三甲基氯硅烷、十二烷基硫酸鈉（SDS），化學(xué)純，上海展云化工有限公司；磷酸二氫鈉，化學(xué)純，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站；其他試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取50.0 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于50 ml容量瓶中，加100 mmol/L醋酸溶液溶解，用100 mmol/L醋酸溶液稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2.2 SDS標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確稱取2.883 8 g SDS標(biāo)準(zhǔn)品于100 ml容量瓶中，加入適量的蒸餾水溶解，用蒸餾水稀釋定容，配制成摩爾濃度100 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2.3 磷酸二氫鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確稱取2.34 g標(biāo)準(zhǔn)品于100 ml容量瓶中，加入適量的蒸餾水溶解，用蒸餾水稀釋定容，配制成150 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.3 涂敷液制備

把乙腈和三甲基氯硅烷按9∶1的體積比準(zhǔn)確量取，倒入50 ml容量瓶中，振蕩搖勻，作為涂敷液備用。

1.4 樣品預(yù)處理

取添加一定量三聚氰胺的純牛奶樣品（即人工純牛奶樣）20 ml加入100 mmol/L 醋酸溶液20 ml稀釋，用力振搖，9 000 r/min 離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜后進行MEKC分析。

1.5 電泳條件

毛細管：總長31.2 cm（有效長度21 cm）×75 μm 內(nèi)徑；分離緩沖液：40 mmol/L 磷酸二氫鈉、20 mmol/L SDS（pH 4.0）；樣品緩沖液：酒精與蒸餾水1∶1（體積比）的溶液；分離電壓：20 kV；檢測波長：234 nm；操作溫度：25 ℃；進樣壓力及時間：3.447 4 kPa、5 s。

1.6 毛細管的洗涂處理

新的毛細管分別用600 mmol/L鹽酸洗5 min，500 mmol/L氫氧化鈉溶液洗5 min，蒸餾水洗5 min，用乙腈洗2次，每次5 min，然后用涂敷液洗2 min，分離緩沖液洗10 min。每次進樣前，分別用鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液、蒸餾水各洗0.5 min 后，乙腈洗2次，每次0.5 min，涂敷液洗1 min，分離緩沖液洗1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂層及波長選擇

考察在電壓、分離緩沖液組分、pH及吸收波長等條件相同下涂層對分離的影響。結(jié)果表明，沒有涂層條件下基線不穩(wěn)，柱效不高，還容易出現(xiàn)倒峰，所以選擇毛細管涂層。在涂層條件下，考察了波長210～254 nm的出峰情況，綜合考慮峰的高低、形狀和柱效，選擇波長為234 nm。

2.2 磷酸二氫鈉濃度的影響

考察了緩沖液中磷酸二氫鈉在10～50 mmol/L 濃度范圍的影響。結(jié)果表明，隨磷酸二氫鈉濃度的增大，三聚氰胺峰遷移時間變化不大，但峰高明顯增高。以人工純牛奶樣測試，過高濃度和低濃度的磷酸二氫鈉緩沖液下三聚氰胺與雜質(zhì)峰重疊，分離效果不好。綜合考慮分離效果和柱效，試驗采用40 mmol/L 磷酸二氫鈉。

2.3 pH的影響

考察了pH 2.0～6.0對三聚氰胺分離的影響。結(jié)果表明，隨著pH減小，遷移時間增長，峰也增高，與雜質(zhì)峰重疊較少，分離選擇性變好，但在pH 2.0時多次掉電流，所以不能選pH 2.0。綜合考慮遷移時間和分析選擇性，選擇pH 為4.0。

2.4 運行電壓的影響

考察了電壓16～24 kV的影響。結(jié)果表明，當(dāng)電壓增大時遷移時間減短，峰高降低。但考慮電壓越高會導(dǎo)致高電流引起焦耳熱問題，選擇電壓為20 kV。

2.5 稀釋液選擇

試驗結(jié)果表明，以蒸餾水為稀釋液時容易掉電流，出現(xiàn)后拖尾、峰分叉、與雜質(zhì)峰重疊等情況。以100 mmol/L醋酸溶液為稀釋液時，峰形差，且容易掉電流。試驗又以20～60 mmol/L磷酸二氫鈉溶液為稀釋液，結(jié)果出現(xiàn)后拖尾現(xiàn)象，樣品峰與雜質(zhì)峰重疊。最后以酒精∶蒸餾水1∶1（體積比）為稀釋液，分離效果好，峰形較理想，所以選擇它為樣品稀釋液。

2.6 精密度

在優(yōu)化電泳條件下，對三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)平行測定5次，計算得到三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液電泳圖中遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和峰高的RSD分別為1.7%和3.8%。

2.7 工作曲線、線性范圍、檢出限

試驗測得線性回歸方程為Y=0.309 54X-0.000 01（Y為峰高，X為濃度），相關(guān)系數(shù)0.998 5，線性范圍10～500 mg/L，定量限為10 mg/L，檢出限為0.48 mg/L。

2.8 樣品分析

用MECC方法測得三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖如圖1，圖中峰1為三聚氰胺峰。 某純牛奶加入一定量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過預(yù)處理后，測得樣品中三聚氰胺的電泳圖如圖2，圖中峰1為三聚氰胺峰。

2.9 回收率

取測試過的人工牛奶樣，加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，攪拌均勻，在優(yōu)化電泳條件下測得峰高，平行5次，計算得平均回收率為91.3%。

3 結(jié)論

采用加涂層的膠束電動毛細管色譜-二極管陣列檢測的方法，三聚氰胺在0.8 min內(nèi)出峰，線性關(guān)系好，檢測限低。

通過改進樣品處理和試驗操作方法，提高回收率，可望滿足乳制品中三聚氰胺的定性、定量測定。

參考文獻

[1] 薛樹科，宋金鳳，時麗艷，等.乳制品中三聚氰胺檢測研究進展[J].河北化工，2010，33（9）：21-27.

[2] 蘇文莉.雞蛋中三聚氰胺含量HPLC檢測方法研究[J].廣西輕工業(yè)，2010，143（10）：8-10.

[3] 趙浩軍，舒平.高效液相色譜法測定雞蛋中三聚氰胺含量[J].大理學(xué)院學(xué)報，2009，8（4）：46-48.

[4] 王維，徐穎，張鳳娟，等.氣相色譜-質(zhì)譜法檢測豆粉中的三聚氰胺[J].化學(xué)分析計量，2010，19（1）：81-82.

[5] 黃芳，黃曉蘭，吳惠勤，等.高效液相色譜-質(zhì)譜法對飼料及食品添加劑中三聚氰胺的測定[J].分析測試學(xué)報，2008，27（3）：313-315.

[6] IHUNEGBO F N，TESFALIDET S，JIANG W.Determination of melamine in milk powder using zwitterionic HILIC stationary phase with UV detection[J].J Sep Sci，2010，33：988-995.

[7] YAN N，ZHOU L，ZHU Z F，et al.Determination of melamine in dairy products，fish feed，and fish by capillary zone electrophoresis with diode array detection [J].Agric Food Chem，2009，57（3）：807-811.

[8] 丁曉靜，楊媛媛，趙珊，等.高效毛細管電泳法快速測定乳制品中三聚氰胺[J].食品科學(xué)，2009，30（18）：245-248.

[9] HUANG G M，OUYANG Z，COOKS R G.Highthroughput trace melamine analysis in complex mixtures [J].Chem Commun，2009，3（5）：556-568.

[10] 張申亮.膠束電動毛細管色譜在中藥化學(xué)成分分析中的應(yīng)用[J].藥學(xué)實踐雜志，2009，27（1）：2l-24.

[11] 王萍，丁曉靜.膠束電動毛細管色譜快速測定化妝品中的防腐劑[J].色譜，2005，23（3）：315.

[12] LUO Z，WANG S M，ZHOU L，et al.Silanizing agent for semipermanent wall coating in micellar electrokinetic capillary chromatography[J].Talanta，2008，76：413-418.