黃小忠 曹志杰 張雪松 凡軍民

摘要[目的]優(yōu)化透明質(zhì)酸搖瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基。[方法]利用Plaekett-Burman設計及響應面分析法（RSM）對透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量的關鍵因子。[結果]影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量的關鍵因子為葡萄糖和酵母膏，葡萄糖最佳濃度為55.78 g/L，酵母膏的最佳濃度為23.43 g/L；在此條件下，發(fā)酵液透明質(zhì)酸的平均產(chǎn)量為0.219（OD400nm）。[結論]通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化，透明質(zhì)酸產(chǎn)量得到提高，試驗值與預測值基本一致。

關鍵詞獸疫鏈球菌；優(yōu)化；透明質(zhì)酸；響應面分析

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00015-02

作者簡介黃小忠（1981-），男，江蘇海安人，講師，碩士，從事生物工程研究，Email：523855294@qq.com。

收稿日期20131209透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，簡稱HA），又名玻尿酸，是一種白色無味的纖維狀或者無定形物質(zhì)，易溶于水。HA的水溶液呈酸性，帶一定的負電荷。其分子是由β-D-葡萄糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復交替連接而成的高分子物質(zhì)，廣泛存在于動物組織間質(zhì)中，也是鏈球菌、綠膿桿菌等菌株莢膜的主要成分[1]。筆者以獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）作為透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌，利用Plaekett-Burman設計及響應面分析法（RSM）對透明質(zhì)酸搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，詳細考察了培養(yǎng)基中葡萄糖和酵母膏濃度對透明質(zhì)酸產(chǎn)量的影響，確定其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳濃度，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus），由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院生物工程系實驗室保藏。

1.1.2 主要儀器。超凈工作臺，離心機，搖床，分光光度計，培養(yǎng)箱。

1.1.3 主要試劑。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB試液）為分析純，市售；無菌水及去離子水，實驗室自制。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備。①斜面培養(yǎng)基。葡萄糖5.0 g/L， 蛋白胨10.5 g/L，牛肉膏5.5 g/L，酵母膏7.14 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂2%，pH值7.0，121 ℃滅菌25 min[2]。②種子培養(yǎng)基。以斜面培養(yǎng)基為基礎不添加瓊脂。③發(fā)酵培養(yǎng)基。蛋白胨10.5 g/L，牛肉膏5.5 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，pH值7.0，121 ℃滅菌25 min。葡萄糖及酵母膏取優(yōu)化后濃度。

1.2.2 培養(yǎng)方法。①菌種活化。取斜面保藏的原始菌種，接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h。②種子培養(yǎng)。取5 ml無菌水沖洗斜面，經(jīng)離心機4 500 r/min離心10 min，去上清液；用無菌水洗滌沉淀2次，重新懸浮于5 ml無菌水中，搖勻后倒入盛有45 ml無菌水的100 ml三角瓶中，振蕩10 min；分別取45 ml液體培養(yǎng)基于250 ml三角搖瓶，加上述菌懸液5 ml，起始pH值7.0，轉(zhuǎn)速250 r/min ，37 ℃下培養(yǎng)18 h。③發(fā)酵培養(yǎng)。取種子液，接種量10%，搖瓶裝液量20%，轉(zhuǎn)速250 r/min，37 ℃下培養(yǎng)24 h[3]。

1.2.3 測定方法。取樣，每瓶抽取不少于6 ml的發(fā)酵液，于5 000 r/min離心5 min，去除培養(yǎng)液中的菌體，小心準確量取5 ml清液，再加入適量的無水乙醇，在4 ℃下沉淀1 h，再次以5 000 r/min離心5 min，去上清液，取沉淀，準確加入10 ml去離子水溶解沉淀，加入CTAB試液，以接種的培養(yǎng)液經(jīng)相同處理后為空白對照，使用分光光度計在400 nm波長下測定吸光度，通過OD值來比較HA的含量[4]。

1.2.4 菌體量測定。利用分光光度計，在波長660 nm處測定一定稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液的吸光度，通過OD值來評價菌體含量的高低。

1.2.5 Plackett-Burman試驗確定關鍵因素。通過單因子試驗，確定各因素的參照范圍，制定基礎發(fā)酵培養(yǎng)基配方[5]，試驗因素水平編碼見表1，利用6因子2水平Plackett-Burman設計試驗選出搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的關鍵因子。

1.2.6 Box-Behnken試驗設計。以最大產(chǎn)量區(qū)進行Box-Behnken設計，因素水平編碼見表2。

2結果與分析

2.1Plackett-Burman試驗確定關鍵因素 由表3可知，經(jīng)過Plackett-Burman試驗的顯著性分析，葡萄糖、酵母膏為顯著影響因子（可信度大于90%，主效應p≤0.1）。因此選取葡萄糖和酵母膏為主要影響因素。

2.2最陡爬坡試驗 根據(jù)Plackett-Burman試驗結果中葡萄糖、酵母膏2個主要影響因素濃度的大小，確定最陡爬坡試驗的方向和變化步長，同時通過最快的速度靠近最大HA產(chǎn)量的區(qū)域。其他因子濃度分別為：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L。由表4可知，主要因素濃度處在第8組試驗的條件下，HA產(chǎn)量最高。故以試驗8的條件作為響應面設計因素水平的中心點。即葡萄糖、酵母膏的濃度分別為55和22 g/L。

2.3響應面法優(yōu)化HA的發(fā)酵培養(yǎng)基 響應曲面法（RSM）廣泛應用可以使得產(chǎn)品的開發(fā)成本得到大幅的降低，產(chǎn)品生產(chǎn)的工藝得到優(yōu)化，產(chǎn)品的質(zhì)量得到提高，尤其對于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化具有其獨特有的優(yōu)勢，除了可以考察各個顯著影響因素之間交互作用對優(yōu)化結果的影響，還能考慮發(fā)酵條件中的各種重要影響因素[6]。

2.3.1 二次回歸模型擬合及方差分析。用SPSS軟件對試驗結果進行回歸分析和方差分析，進行回歸擬合可以得到產(chǎn)量Y對編碼自變量X1、X2的回歸方程：

2.3.2 響應面分析。利用Design-Expert軟件，結合回歸方程繪制出響應面分析圖及等高線圖（見圖1）。響應面圖代表2個獨立變量之間的相互作用，由響應面和相應的等高線可以看出，兩因素之間的相互作用都比較明顯[7]。

為了進一步確定HA最大產(chǎn)量的穩(wěn)定點，對回歸方程進行整理，解方程得模型的極值點為X1=55.78 g/L，X2=23.43 g/L，代入回歸方程，解得預測HA產(chǎn)量為0.221（OD400nm）。經(jīng)過進一步的驗證試驗，通過3次平行試驗，得到發(fā)酵液HA平均產(chǎn)量為0.219（OD400nm），與模型的預測值接近，說明該模型能較好地預測實際發(fā)酵情況。

3結論

試驗結果表明，通過Plackett-Burman設計試驗和最陡爬坡試驗以及Box-Behnken設計三者相結合是比較適合于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗設計組合，能快速方便的優(yōu)化培養(yǎng)基成分以及確定發(fā)酵工藝的關鍵因素。Design-Expert是一種能方便的進行Plackett-Burman設計和響應面優(yōu)化分析的軟件，使用該軟件進行數(shù)據(jù)處理得到的結果比較可靠，能滿足相關試驗對數(shù)據(jù)處理的要求。