李然 田兆豐 張飛云

摘要[目的]研究擬南芥中Fibrillarin基因的克隆、表達及純化，并探索其與ak6蛋白的相互作用。[方法]利用pGEX6P1與Fibrillarin基因構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達，運用同樣方法構(gòu)建PET28aak6原核表達質(zhì)粒，獲得Hisak6融合蛋白，并運用體外pull down技術(shù)驗證二者的相互作用。[結(jié)果]在溫度為37 ℃、誘導時間為16～20 h、IPTG濃度為0.5 mmol/L時，fibrillarin蛋白的純化濃度最高。試驗成功獲得了符合標準的RNA，并獲得了與預(yù)期片段大小相符的清晰的目的條帶；pulldown試驗結(jié)果表明，擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白具有相互作用。[結(jié)論]擬南芥ak6突變體植株可能由于ak6的缺失影響了rRNA前體的加工，從而抑制核糖體的合成，進而阻礙擬南芥莖的生長，使植株表現(xiàn)明顯的矮小癥狀。

關(guān)鍵詞擬南芥；fibrillarin蛋白；ak6

中圖分類號Q785文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00020-04

基金項目國家自然科學基金項目（31071075）。

作者簡介李然（1988- ），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學，Email：lran1988@163.com。*通訊作者，副教授，碩士生導師，從事植物分子生物學和植物分子病毒學研究，Email：feiyun39@126.com。

收稿日期20131209隨著人類基因組計劃的完成和后基因組時代的到來，對人體內(nèi)一些結(jié)構(gòu)和功能未知蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)成為一個熱點，因為通過對這些蛋白質(zhì)的研究可以使人類更進一步地認識自己，從而為人類一些相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

核糖體RNA，即rRNA，是最多的一類RNA，占RNA總量的82%左右，其也是3類RNA（tRNA、mRNA和rRNA）中相對分子質(zhì)量最大的一類RNA，能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體。其功能是作為mRNA的支架，使mRNA分子在其上展開，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的合成，單獨存在時不執(zhí)行此功能。rRNA可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機”。研究幫忙，擬南芥fibrillarin蛋白是核小核糖核蛋白顆粒（snRNP）中的組分，結(jié)合于U3、U8、U13 snRNP的RNA，參與rRNA前體的第一步加工，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯過程。擬南芥ak6突變體植株較擬南芥野生型植株明顯矮小。

腺苷酸激酶（Adenylate kinase，AK）是一種核苷酸單磷酸激酶（Nucleoside monophosphate kinases，NMPKs），廣泛存在于生物體中，能可逆地催化γ磷酸基團的轉(zhuǎn)移（通常作用于ATP），將ATP和AMP反應(yīng)，生成2分子的ADP，以此來維持細胞內(nèi)的能量平衡[1]。因此，腺苷酸激酶在細胞的新陳代謝以及DNA和RNA的合成中扮演著重要的角色。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并深入研究了其前5種亞型（AK1～AK5）。研究表明，這些酶在核苷酸的合成中起著重要的作用，在各種細胞代謝過程中都是必需的[11-12]。由于腺苷酸激酶涉及細胞中核苷酸的合成與代謝，所以對治療用的核苷和核苷類似物的化療藥物進行活化及代謝也是必需的。ak6是Hui Ren（2004）等在人體腎上腺中發(fā)現(xiàn)了一個定位于細胞核的新型腺苷酸激酶[7]。目前，AK6基因已在大多數(shù)動物如人類、果蠅、線蟲以及酵母中有了較深入的研究，但在植物中鮮有報道，課題小組前期的研究表明，aak6-/aak6-突變體植株與野生型植株相比，突變體植株表現(xiàn)明顯的矮小狀況[13-14]。

fibrillarin蛋白參與rRNA前體的加工過程，影響植株的能量代謝，推測可能影響擬南芥的生長狀況。筆者構(gòu)建了fibrillarin蛋白的表達載體，并對其進行表達、純化，然后用體外pull-down、SDS-PAGE和western blot檢測技術(shù)，探究擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白是否存在相互作用，以期找到突變體植株矮小的原因。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒。pET28a載體、pGEX6P1載體、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α與TOP10、BL21（DE3），均為實驗室保存。

1.1.2主要試劑。Trizol，購自美國TELTEST Inc；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Fermerters公司；高保真PCR試劑盒、隨機引物和TA cloning 試劑盒，均購自全式金公司；各種構(gòu)建載體所需工具酶（如限制性內(nèi)切酶、TapDNA聚合酶、T4連接酶等），均購自Takala公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自QINGEN公司。

1.2方法

1.2.1RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及檢測。以生長4周左右的擬南芥（未抽薹）的葉片為材料，用Trizol法提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2Fibrillarin基因的擴增。根據(jù)GenBank中ig52490序列利用PrimerPremier5.0設(shè)計引物，上游BamH1 酶切位點，下游加入EcoR1酶切位點，引物序列為：

以制備好的擬南芥cDNA為模板，擴增體系為50 μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性：94 ℃，5 min；變性：94 ℃，30 s；退火：58 ℃，40 s；延伸：72 ℃，1 min；30個循環(huán)后，72 ℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取出4 μl進行電泳，檢測是否擴增出目的片段，檢測到目的片段后用膠回收試劑盒進行回收。

1.2.3原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定。將純化后的PCR產(chǎn)物和pGEX6P1分別用限制性內(nèi)切酶BamH1和EcoR1進行雙酶切，膠純化回收以后將PCR產(chǎn)物與pGEX6P1線性片段連接，16 ℃連接過夜，連接體系如表1所示。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，37 ℃活化1 h后涂LB AMP抗性平板，置37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后，用抗生素篩選后的單克隆進行如下程序檢測：菌落PCR篩選-酶切檢驗-測序，最終找出正確的重組克隆。

1.2.4重組蛋白在大腸桿菌中的表達和純化。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞表達菌株，將表達檢測成功的樣本接種到200 ml含50 μg/ml氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)，然后以1∶20接種到大瓶LB培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm為0.6，然后加入0.5 mmol/L的IPTG誘導，于16 ℃培養(yǎng) 16 h；然后于8 679 r/min，10 min低溫離心，棄掉上清；用5.0 ml PBS懸浮沉淀，超聲破碎，在4 ℃，14 000 r/min 離心30 min，收集上清，上清和沉淀分別留少許樣進行SDSPAGE檢測。在上清中加入適量GST beads，于4 ℃旋轉(zhuǎn)令其吸附蛋白2.5 h；于4 340 r/min，3 min離心棄上清；加入至少50 ml的PBS溶液，輕搖至beads懸浮于溶液中，于4 340 r/min，離心3 min，棄上清；重復(fù)用PBS洗beads 2次；加入1.0 ml的GST Elution Buffer，輕搖10 min；于4 340 r/min，離心3 min，收集上清；重復(fù)用 GST Elution Buffer洗2次，收集上清進行SDSPAGE檢測，進行SDSPAGE電泳檢測。

1.2.5ak6蛋白的制備。采用“1.2.4”中方法獲得表達的擬南芥。

1.2.6體外pulldown尋找與fibrillarin相互作用的蛋白及免疫檢測。用200 μl的GST beads和1.0 ml的GSTfibrillarin蛋白在4 ℃混合，將過表達的HISAK6蛋白混合液加入經(jīng)處理的GST beads中，在4 ℃旋轉(zhuǎn)混合孵育10 h，用冰冷的細胞裂解液重復(fù)洗滌3次，然后采用SDSPAGE方法對結(jié)果進行檢測。將跑好的膠在冰浴中轉(zhuǎn)PVDF膜1 h，再將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，依次用去離子水和PBST稍加漂洗，然后浸沒于封閉液（脫脂牛奶）中，于4 ℃緩慢搖蕩1 h；然后加一抗（AK6單抗），4 ℃搖動孵育12 h過夜；用PBST洗膜3次，每次5 min；之后加入羊抗鼠二抗，用PBST再洗膜3次，每次15 min；最后進行自顯影。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄用Trizol從擬南芥的葉片中提取RNA，根據(jù)檢測的濃度利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆?，結(jié)果表明成功獲得了符合標準的RNA（圖1）。

2.4.1ak6引物。

2.4.2載體構(gòu)建和重組蛋白的表達純化。成功構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28aak6獲得ak6蛋白，其中載體pET28a中帶有HIS標簽，用ak6的單克隆抗體作為后續(xù)pulldown試驗中進行western blot檢測所以的一抗，鑒定ak6蛋白，從而證明擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白具有相互作用。

2.5核糖體組成蛋白fibrillarin與ak6相互作用將純化后的HISak6融合蛋白和GST fibrillarin融合蛋白及pGEX6P1蛋白同時加入到GST beads中，4 ℃共同孵育10 h，經(jīng)離心收集洗脫復(fù)合物和洗滌后，取膠，在冰浴中轉(zhuǎn)PVDF膜2 h，再加入ak6單克隆抗體過夜，洗脫，加二抗，最后進行自顯影，結(jié)果如圖5所示，證明二者存在相互作用。

試驗選取擬南芥作為研究對象，構(gòu)建了fibrillarin蛋白的表達載體，通過對誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度等條件的摸索，發(fā)現(xiàn)在溫度為37 ℃、誘導時間為16～20 h、IPTG濃度為0.5 mmol/L時，fibrillarin蛋白的純化濃度最高。

生物體進行一系列的生命活動需要化學能，而這些化學能的獲得絕大部分是來自于ATP。ATP是一種高能化合物，通過一系列的代謝過程，例如糖酵解、三羧酸循環(huán)以及氧化磷酸化來產(chǎn)生。ATP的能量轉(zhuǎn)移使得動植物的各種重要生命活動有了能量來源，如肌肉收縮、神經(jīng)信號的傳導、主動運輸?shù)龋３种矬w生命活動的正常進行。利用ATP轉(zhuǎn)移走一個磷酸基團生成ADP，然后ADP再獲得一個磷酸基團生成ATP，以此完成ATP的利用循環(huán)。換言之，這種以ATP為中介物的生成與再利用循環(huán)是生物體能量流動的核心，并以此維持著生物體的各項生命活動。

ak6是腺苷酸激酶的一種，根據(jù)前人研究，除酵母外，人類、線蟲、果蠅中的ak6的同源蛋白都具有激酶活性[9-10]，能使所有類型的NTPs和dNTPs充當磷酸供體，為細胞代謝提供能量。課題組為探索缺失ak6的突變體植株與野生型相比長勢矮小的原因，通過體外試驗尋找與ak6蛋白具有相互作用的功能蛋白。由于在進行pulldown試驗時加入的是GST beads，那么在收集的上清液蛋白中，只可能存在帶有GST標簽的蛋白以及與其發(fā)生相互作用的蛋白，westblot檢測時加入ak6抗體，使HISAK6融合蛋白與之結(jié)合，結(jié)果表明抗體是與ak6結(jié)合而不是與GST標簽結(jié)合，從而證明擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白發(fā)生了特異性結(jié)合，二者存在相互作用。fibrillarin蛋白在生物體內(nèi)參與rRNA前體的加工，那么可以推測，突變體植株長勢矮小，可能是由于ak6的缺失，導致fibrillarin蛋白與其無法融合，影響了rRNA的合成，使核糖體的合成發(fā)生障礙，影響細胞能量代謝，從而使植株長勢矮小。但這僅是推測，結(jié)論還有待進一步考證。

試驗成功構(gòu)建了帶有GST標簽的擬南芥中fibrillarin蛋白的表達載體，在原核生物大腸桿菌中對重組蛋白進行了誘導表達，純化后得到了fibrillarin蛋白；通過體外pulldown試驗證明，擬南芥中的fibrillarin蛋白與ak6蛋白具有相互作用。

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